Замораживание костного мозга

 

Такие тяжелые заболевания системы крови, как лучевая болезнь, лейкозы,
гипопластические анемии, одно из важных мест принадлежит методу трансплантации
кроветворной ткани. Сохранение жизнеспособности клеток костного мозга представляет
немалые трудности. При температуре 4° она сохраняется в течение 48 часов, а при
добавлении ограждающих растворов - до 5-6 суток. Слишком короткий период хранения
костного мозга затрудняет его применение в экстренных случаях и создание необходимого
запаса клеток костного мозга.

Метод: медленное охлаждение костного мозга до -15° (1° в минуту) с последующим
ускоренным (10°и более в минуту) замораживанием клеток в среде, содержащей
глицерин. Хранят замороженные клетки при температура ниже -70°.

Впервые применили этот метод при консервировании клеток костного мозга мышей и
не обнаружили снижения жизнеспособности. Снижение жизнеспособности
гемопоэтических клеток во время хранения при температуре -70° и -80°. Что же касается
лечебного эффекта, то большинство исследователей не наблюдали разницы в
выживаемости животных, леченных свежим костным мозгом и костным мозгом,
хранившимся в среде с глицерином при -70° и -80° в течении различного времени.

В качестве защитных веществ, кроме глицерина, были испытаны аминокислоты,
поливинилпирролидон, диметилсульфоксид. Было доказано некоторое преимущество перед
глицерином только диметилсульфоксида (ДМСО).

Трансплантация костного мозга, консервированного замораживанием в
присутствии ДМСО, обеспечивает более быстрое восстановление морфологической
картины периферической крови облученных мышей, чем пересадка костного мозга,
замороженного с глицерином. Однако не разработан достаточно надежный метод
освобождения клеток костного мозга от ДМСО после оттаивания, и поэтому пользуются
теми же методами, какие применяют при освобождении от глицерина то есть
многократную смету среды глюкозо-солевым или глюкозо-сахарозным раствором в
сочетании с центрифугированием. Такая обработка ведет к значительному разрушению
клеток костного мозга. Допускается трансплантация костного мозга без удаления ДМСО
при условии разбавления суспензии раствором Эрла. Также некоторые доказательства
большей токсичности ДМСО по сравнению с глицерином. И ДМСО, и глицерин вызывают
выраженные изменения клеток, обнаруживаемые с помощью электронного микроскопа
(450). Имеются также сообщения о выраженном защитном действии поливинилпирролода
при сверхбыстром замораживании костного мозга в жидком азоте (240). Освобождать
клетки костного мозга от этого препарата не требуется.

Костный мозг получают путем хирургического иссечения или пункции иглой с
последующей аспирацией из грудины, позвонков, костей таза как от здоровых животных и
людей-доноров, так и от трупов впервые 4-6 часов после смерти. Для извлечения
наибольшего числа неповрежденных клеток путем аспирации необходимо применять иглы
большого диаметра. В настоящее время разработана закрытая система получения костного
мозга, обеспечивающая смешивание аспирированного костного мозга с
гепаринизированной жидкостью в условиях максимальной стерильности. Путем аспирации
получают в среднем 6,2x109 клеток костного мозга.

Консервированный костный мозг иногда трансплантируют без обработки, а чаще его
измельчают и фильтруют через нейлоновый или стальной фильтр и удаляют
центрифугированием жир. Желательно также добавлять консервант в качестве
разбавляющего раствора перед обработкой костного мозга. С целью размельчения и
освобождения от жира аспирированный костный мозг пропускают несколько раз
через два сита с размером ячеек 380 и 80 мк. Перед замораживанием к костному мозгу
добавляют равный объем ограждающего вещества в среде Хэнкса или солевом растворе
Эрла. Смесь перемешивают, центрифугируют и надосадочную жидкость удаляют.
Концентрированную суспензию клеток костного мозга пропускают через нейлоновый
фильтр и помещают в алюминиевые контейнеры, пластиковые мешки или стеклянные ампулы для замораживания и хранения при низких температурах. В качестве защитных сред
используют 15-20%-ный раствор поливинилпирролидона, 15%-ный ДМСО и 15-25%-ный
раствор глицерина.

Охлаждают костный мозг медленно (1° в минуту) до температуры -12-20°, а затем по
10° и более в минуту до -70° и ниже. Медленно замораживают чаще всего в ваннах со
спиртом, куда постепенно добавляют сухой лед. В. Г. Михайлов и Ф. А. Казанцев
рекомендуют пользоваться при двухэтапном замораживании костного мозга
замораживающей камерой сушильного аппарата «Юзифруа», температура
охлаждения которой поддерживается в пределах -30-40°. В этой камере можно
осуществить первый этап замораживания до -15-20°, понижая температуру в материале со
скоростью приблизительно 1 в минуту. Замороженный таким образом костный мозг
дальше охлаждают жидким азотом со скоростью не менее 10° в минуту и хранят при -196° в
течение длительного времени (не менее 4 лет).

С. С. Лаврик считает возможным замораживать клетки костного мозга путем
сверхбыстрого охлаждения жидким азотом (-196°). При хранении костного мозга при -70-
80° частично разрушаются костномозговые клетки. Поэтому свыше 2 лет рекомендуется
хранить костный мозг при -196° в жидком азоте.

Важное значение для сохранения структуры клеток костного мозга имеет режим
оттаивания. Большинство исследователей рекомендуют быстро оттаивать костный мозг в
водяной бане при 40-45°, поднимая температуру материала не выше 15°. Однако в
отдельных сообщениях указывается на необходимость медленного оттаивания костного
мозга.

Консервирование гемопоэтической ткани путем замораживания имеет важное значение
не только с целью создания запаса костного мозга, но и с точки зрения снижения
проявления свойств биологической несовместимости. По данным ряда исследователей,
продолжительное хранение гемопоэтической ткани в замороженном состоянии снижает или
полностью лишает костный мозг биологической несовместимости.

Анализ данных позволяет рекомендовать следующие условия замораживания
костного мозга.

1.Костномозговую ткань помещают в стерильные бутылочки или в двухслойные
полиэтиленовые мешочки и смешивают пополам с консервирующей жидкостью. В качестве
консервирующей жидкости можно использовать солевой раствор Тироде, гомологичную
сыворотку, растворы ЦОЛИПК № 2, № 3 и № 7 или раствор Рингера, содержащие 25-30%
глицерина или 15% диметилсульфоксида. Хорошие результаты получены и при
использовании чистого глицерина.

2. Смесь костного мозга с консервирующим раствором выдерживают при 5 в течение 1-
1*/2 часов, после чего медленно (со скоростью 1° в минуту) охлаждают до -10-15°. Дальше
охлаждают быстро (по 10-15° в минуту) до -75-80° и ниже. Охлаждать можно смеси сухого
льда со спиртом (-78°), в жидком азоте (-196°) или в холодильнике с программированным
охлаждением до -100-120°. Хранить замороженные клетки рекомендуется при -75-130° или -
196°.

3. Размораживают клетки костного мозга быстро, погружая сосуды (мешочки) с
замороженным материалом в водяную баню при температуре 37-40°.

4. После размораживания суспензию центрифугируют при 1000-1300 об/мин,
консервирующий раствор сливают, а концентрированную ткань заливают изотоническим
раствором хлористого натрия (рН 7,2; 7,4) или раствором Рингера, содержащим в 1 мл по
100-500 ЕД пенициллина. Процедуру отмывания повторяют 2-3 раза, после чего клетки
выдерживают при 38° в течение 30-40 минут и считают годными для трансплантации.

 

 

Замораживание лейкоцитов

 

Лейкоцитная масса является хорошим средством терапии ряда заболеваний системы
крови. Лейкоциты проявляют выраженную способность пролиферировать вне организма,
являясь строго специфической средой для, репродукции ряда вирусов. Трудность
использования, лейкоцитов связана с исключительной неустойчивостью этих клеток вне
организма животных и человека и очень коротким сроком сохранения их.

При положительных температурах быстро затухает энергетический обмен в клетках, а
также нарушается координация различных сторон.

Лейкоциты оказались более чувствительными и к действию замораживания, чем
многие другие биологические препараты, в том числе эритроциты и клетки костного
мозга.

Перед замораживанием лейкоциты, взвешенные в плазме, смешивают пополам с
одним из указанных соединений, растворенным на среде Тироде, Эрла, Хэнкса или 199
(последние две среды непригодны для внутривенных введений). Лейкоцитную взвесь
наливают в полиэтиленовые мешочки, ампулы или алюминиевые контейнеры от 1 до 250 мл
с таким расчетом, чтобы обеспечить максимальную поверхность для равномерного
охлаждения. До -15 взвесь охлаждают со скоростью 1° в минуту, а затем до -70-80° по
10° в минуту. Можно замораживать в холодильных камерах с охлажденным спиртом или
метилцеллосольвом, а также в емкостях со смесью льда и спирта.

Хранить лейкоцитную массу в замороженном состоянии желательно при температуре
жидкого азота. В течение 2 лет можно хранить при температуре -75-80°.

Оттаивают лейкоцитную массу быстро, погружая емкость с препаратом в водяную баню,
подогретую до 40°. Температура нагрева материала не должна превышать при этом 10-15°.
После оттаивания взвесь лейкоцитов желательно освободить от гипертонической
концентрации защитной среды. Учитывая повышенную по сравнению с эритроцитами
осмотическую резистентность лейкоцитов, взвесь их центрифугируют, надосадочную
жидкость удаляют и замещают ее необходимым количеством нужного изотонического
раствора.

Для целей трансфузии размороженную лейкоцитную массу можно просто медленно
разбавлять изотоническим раствором сахарозы с 0,05 или 0,1% ЭДТА с таким расчетом,
чтобы общая концентрация веществ в разбавленной взвеси с защитными препаратами не
превышала изотонию в 2-2,5 раза. Таким образом, обработка лейкоцитов после их
оттаивания сводится к весьма несложной технологии разбавления или замещения
концентрированного раствора изотонической жидкостью для трансфузии или питательной
средой для культивирования тканей.

Количество жизнеспособных лейкоцитов определяют путем суправитальной окраски
эозином, измерением степени фагоцитарной активности размороженных лейкоцитов и
интенсивностью пролиферативной реакции в пробирках или флаконах с питательной средой для выращивания культуры тканей.

 

Замораживание тромбоцитов

 

Тромбоциты, или кровяные пластинки, оказывают высокоэффективное действие при
лечении больных с тромбоцитопенией, сопровождающейся нарушениями свертываемости и
кровоизлияниями. Указанные явления особенно характерны лейкемиям и апластическим
анемиям, возникающим в результате лучевого и лекарственного воздействий.

Кровяные пластинки относятся к весьма неустойчивой фракции крови. Быстрая потеря
гемостатических свойств, кровяными пластинками объясняется очень коротким сроком их
функциональной деятельности, исчисляющимся лишь 4-8 днями.

При консервировании при положительных температурах не сохраняется
физиологическая полноценность тромбоцитов, продолжительность их жизнеспособности в
этих условиях равняется 4-7 дням. При этом уже через сутки их функциональная активность

снижается более чем наполовину.

Тромбоцитам, как и другим форменным элементам крови, присущ энергетический
обмен (главным образом гликолиз), который поддерживает их структурную целостность,
физиологические свойства и функции. С энергетическим обменом тесно связана
ретрактильная активность их. Нарушение энергетического обмена тромбоцитов
сопровождается потерей их ретрактильной активности и жизнеспособности. Следовательно,
ретрактильная активность тромбоцитов может служить тестом определения их
жизнеспособности. Добавление препаратов (АТФ, аденина, инозина и фосфатов),
поддерживающих углеводно-фосфорный обмен на определенном уровне, увеличивает
продолжительность сохранения ретрактильной активности кровяных пластинок до 6-10
суток.

Несмотря на большие успехи в деле консервирования замораживанием эритроцитов,
лейкоцитов и клеток костного мозга, попытки так же консервировать тромбоциты были
неудовлетворительны.

Создание низкотемпературной аппаратуры с программным охлаждением, а также
дальнейшее развитие способов замораживания с привлечением высокоэффективных
защитных сред способствовало разработке режимов замораживания тромбоцитов с высоким
процентом сохранения жизнеспособных клеток.

Ретрактильную активность тромбоцитов определяют по общепринятой методике. Для
этого в прокаленную градуированную пробирку для ретракции емкостью 1,3 мл и ценой
деления 0,1 мл вводят 1 мл свободной от тромбоцитов плазмы, 0,2 мл суспензии ис-
пытуемых тромбоцитов (не отмытых) и 0,1 мл 0,25М раствора СаСЬ. Смесь тщательно
перемешивают и после свертывания переносят в термостат при 37° на один час.
Образовавшуюся сыворотку осторожно, не давя на сгусток, отсасывают пастеровской
пипеткой и сливают в мерную пробирку. Полученный объем сыворотки, выраженный в
процентах от общего объема смеси (1,3 мл), характеризует степень ретрактильной
активности тромбоцитов.

В качестве защитных растворов при замораживании тромбоцитов можно использовать
15%-ный диметилсульфоксид, 8%-ный глицерин и 15-20%-ный поливинилпирролидон.
Однако поливинилпирролидон влияет на ретрактильную активность тромбоцитов, что
затрудняет оценку его защитного действия. Более выраженными защитными свойствами
при замораживании тромбоцитов обладает диметилсульфоксид. Взвесь тромбоцитов
замораживают в пластикатных мешках, алюминиевых контейнерах и других емкостях,
обеспечивающих максимальную поверхность взаимодействия с хладоагентом
(хладопосителем). Охлаждать можно с одинаковым успехом при двух режимах: 1) снижать
температуру до -13° по 1° в минуту и затем до -196° по 10° в минуту; 2) снижать
температуру до -196° по 10° в минуту. Сверхбыстрое замораживание приводит к потере рет-
рактильной активности тромбоцитов.

Замороженную тромбоцитную взвесь хранят в жидком азоте.

Оттаивать тромбоцитную взвесь, так же как и другие форменные элементы крови,
необходимо быстро в воде, подогретой до 40-45°, с таким расчетом, чтобы тромбоцитная
взвесь не нагревалась выше 15°. В процессе замораживания и оттаивания тромбоцитов,
взвешенных в 15%-ном растворе диметилсульфоксида, сохраняется до 75-78%
жизнеспособных клеток. Такая активность удерживается при -196° не менее 2 месяцев.
Ретрактильная активность тромбоцитов заметно снижается после 6-месячного хранения, а через год составляет около 40-45% исходной величины. Необходимо отметить, что так же
снижается ретрактильная активность тромбоцитов при 4° через 5-6 дней.

Из изложенного следует, что замораживание тромбоцитов обеспечивает
удовлетворительное сохранение их реграктильной активности в течение 2-12 месяцев.

 

Замораживание бактерий

 

Действие холода на микроорганизмы давно интересовало ученых. Первые исследования
показали, что бактерии и дрожжи хорошо переносят глубокое охлаждение и хранение в
замороженном состоянии. Однако последующими исследованиями было отмечено, что,
чувствительность бактерий к замораживанию и оттаиванию сильно варьирует в
зависимости от их принадлежности к тому или иному виду. Особенно чувствительными к
замораживанию оказались большинство кишечных бактерий. Процент выживаемых
бактерий зависел от среды, в которой их замораживали, индивидуальных особенностей
различных видов бактерий, от скорости замораживания и оттаивания и продолжитель-
ности хранения в замороженном состоянии.

При замораживании кишечной палочки, суспендированной в воде, и хранении ее при
температуре -20° в течение 5 дней выживало не более 1 % бактерий, а замораживание в
молоке при той же температуре обеспечивало сохранение большего процента бактерий.
Кейт (800) установил, что при добавлении к суспензии от 5 до 42% глицерина
значительный процент бактерий сохранялся при -20 не менее 6 месяцев. Им было отмече-
но также выраженное защитное действие сахарозы при воздействии температуры -10°.
Необходимо отметить, что очень ценное наблюдение Кейта о защитном действии
глицерина при замораживании бактерий было забыто и вновь возрождено только через 40
лет Польджем при консервировании замораживанием сперматозоидов и эритроцитов.

Еще первыми опытами было показано, что отмирание бактерий связано не столько с
продолжительностью хранения их при низких температурах, сколько со скоростью
замораживания и оттаивай и. Особенно губительно для чувствительных к замораживанию
бактерий чрезмерно быстрое охлаждение. Быстрое же оттаивание не влияет существенно на
жизнеспособность бактерий. Тем не менее, отдельными исследователями было показано,
что при сверхбыстром замораживании Е. соli и St. aureus по методу капельного
замораживания крови в жидком азоте бактерии не повреждаются. В то же время
выживаемость Sac. cerevisiae, замороженной таким способом, составила 42±7%, Аzotobacter
vineleudii 28,2±8%, а Asp. niger только 22±8%, что свидетельствует о видовых различиях в
чувствительности микроорганизмов к замораживанию. Следовательно, перевод их при
замораживании непосредственно в стекловидное состояние, минуя стадию кристаллизации,
благоприятно отражается на сохраняемости. В связи с этим вряд ли можно отнести
значительную гибель микроорганизмов при сверхбыстром замораживании за счет их
витрификации. По-видимому, наблюдавшееся в опытах большинства исследователей значи-
тельное отмирание бактерий в процессе сверхбыстрого и быстрого замораживания являлось
не следствием их витрификации, а результатом температурного шока, воздействия
концентрированных солей и кристаллизации, предшествовавших стадии витрификации.

Кроме перечисленных факторов, на устойчивость бактерий в процессе замораживания и
последующую их репродукцию значительно влияют условия культивирования, защитные
среды и способы их применения, возраст культуры и др.

Маклеод с сотр. нашли, что клетки при замораживании повреждаются в основном за
счет частичного или полного нарушения целостности цитонлазматичеокой мембраны и
потери способности к образованию внутрикомплексных соединений с ионами металлов, а
Шаховский считает, что это происходит за счет разрушения бактериальной оболочки.
Культивирование размороженных бактерий на обогащенных средах, содержащих пептон,кровь, сыворотку или мясной бульон, способствует восстановлению жизнеспособности
частично поврежденных клеток.

Арпаи показал, что выживаемость бактериальных клеток при замораживании и
оттаивании в значительной степени зависит от количественного содержания нуклеиновых
кислот в них. Чем больше накоплено нуклеиновых кислот в клетках, тем они
устойчивее при замораживании и оттаивании, а накопление нуклеиновых кислот
практически связано со средой культивирования. На бедных питательных средах
(синтетических) в клетках накапливается незначительное количество нуклеиновых
кислот, в то время как при культивировании бактериальных клеток на обогащенных
питательных средах отмечается выраженное накопление нуклеиновых кислот. Эта гипотеза,
основанная на эксперименте, подтверждается рядом исследователей, отмечавших более
выраженную устойчивость к замораживанию у бактериальных клеток, выращенных на
обогащенной питательной среде, по сравнению с клетками, выращенными на
синтетической среде. Изучая факторы, влияющие на скорость гибели клеток ЕзсЬег.
со!) при повторном замораживании и оттаивании, Паккер с сотр. пришел к выводу, что
выживаемость бактерий не зависит от фазы развития, аэробности или анаэробностн, а также
от концентрации клеток в суспензии. Аналогичного мнения придерживаются Харристон
и Черрони. Разведение питательной среды параллельно увеличивает процент погибших
клеток. Сохранению клеток способствует наличие глюкозы и защитного фактора в среде
выращивания. О наличии защитного фактора в среде, на которой выращивались
бактерии, сообщили также Бретц и Амброзини (593). Авторы относят этот фактор к
продуктам метаболизма клеток.

Исключительное влияние на выживаемость бактериальных клеток при
замораживании и хранении при низких температурах оказывают защитные среды. Из
большого числа испытанных защитных сред (молоко, глюкоза, сахароза,
диметилсульфоксид, маннитол, этиленгликоль, глицерин) наиболее выраженным
защитным действием обладает глицерин. Некоторые из перечисленных веществ обладают
бактериостатическими и бактерицидными свойствами при хранении бактерий в жидких
средах (диметилсульфоксид, маннитол, пиридин-N-окси, глицерин, этиленгликоль). В
то же время после обезвоживания препаратов замораживанием или высушиванием эти
вещества проявляют выраженное защитное действие. Харрисон провел ряд опытов,
доказывающих влияние снижения исходной концентрации солей на выживаемость бактерий
при замораживании до -22 и хранении при этой температуре. По мере разбавления
питательной среды дистиллированной водой повышалась выживаемость при
замораживании Е. соli. Аналогичные результаты получены с Serrtia marcescens и
Lactobacillum fermenti/

Серией таких же опытов Харрисон показал влияние первичной концентрации бактерий
на их выживаемость при замораживании. Смертность была тем выше, чем меньше было
исходное число жизнеспособных бактерий. Вредное влияние концентрации солей при
замораживании почти полностью снимается добавлением глицерина, 20-30% глюкозы, 5%
автоклавированного желатина и других веществ. Однако повреждающее действие
замораживания на бактериальные клетки нельзя объяснить только повышенной концентра-
цией солей, поскольку при быстром замораживании бактерий в дистиллированной воде, не
содержащей солей, процент гибели клеток весьма высок. В этом случае вступает в действие,
по-видимому, внутриклеточная кристаллизация, способствующая разрушению бактерий с
потерей их жизнеспособности. Данные Обаяси (928) показали, что растворы глюкозы не
полностью предохраняют культуру БЦЖ при быстром замораживании до температуры -70°.

Подтверждением сказанному является полная выживаемость бактерий при
сверхбыстром замораживании 'суспензии в форме капель в жидком азоте, когда клеточная
вода в результате быстрого охлаждения до температуры -196° переводится в стекловидное
состояние, минуя стадию кристаллизации (650). При рассмотрении вопроса о влиянии скорости замораживания на бактериальные клетки необходимо учитывать температуру, при
которой ведут замораживание.

Ю. Л. Субботина (432) показала, что при охлаждении от -15 до -37° и быстром
оттаивании не отмечается разницы в выживаемости суспензии БЦЖ. В тех же суспензиях,
быстро охлажденных до более низких температур (-45-65°), количество жизнеспособных
бактерий было значительно меньше. Аналогичные данные были получены Мазуром (877,
878) при изучении влияния скорости и температуры замораживания на Р. tularensis.

Изложенные выше данные свидетельствуют о том, что на выживаемость бактерий
при замораживании действует исключительное множество факторов, которые
необходимо учитывать при консервировании бактериальных взвесей на длительный срок.
Повреждающее действие замораживания в значительной степени нивелируется
глицерином, поэтому его использование при замораживании бактерий можно
считать в настоящее время обязательным. Использовать глицерин при замораживании
бактерий с целью последующей лиофилизации нежелательно вследствие весьма низкой
степени его испарения в условиях вакуума при низких температурах.

Обобщая приведенные данные по изучению влияния замораживания на бактериальные
клетки, можно заключить, что трудно разработать единый рецепт по сохранению бактерий в
замороженном состоянии. Тем не менее, необходимо отразить основные условия, обеспе-
чивающие максимальную сохраняемость бактерий при замораживании и длительно
хранении при низких температурах.

1. Перед замораживанием к бактериальным суспензиям добавляют глицерин в
количестве 15% к объему суспензии.

2. Глицеринизированную бактериальную суспензию разливают в ампулы по 1-2 мл с
целью равномерного охлаждения в процессе замораживания. При необходимости
замораживания бактериальных суспензий в большом объеме их наливают во флаконы с
таким расчетом, чтобы в процессе замораживания можно было суспензию равномерно
раскатать по стенкам флаконов с образованием слоя льда толщиной не более 1 см.

3. До температуры -20-25° замораживают с любой скоростью, до более низких
температур - медленно, со скоростью не более 1-2° в минуту.

4. Оттаивать бактериальные суспензии во всех случаях необходимо максимально
быстро, помещая ампулы и флаконы с замороженным материалом в водяную баню при
температуре 35-38.

5. Многократные замораживания и оттаивания губительно отражаются на
жизнеспособности бактерий.

6. В случае отсутствия глицерина в качестве защитных сред при замораживании
бактерий используют глюкозу, сахарозу и лактозу в количестве 10-30%,
диметилсульфоксид 15%, желатозу (двукратно автоклавированную желатину) 5-10%,
пептон 5%, инактивированную при 56° в течение одного часа сыворотку крови животных
30-50%, обезжиренное молоко 30-50%.

7. Средняя продолжительность хранения глицеринизированных бактериальных
суспензий без пересева приблизительно следующая: при -15-20° 6 месяцев; при -30° 6-9
месяцев; при -40° один год; при -50-60° до 3 лет; при -70-80° и ниже не менее 10 лет.

Замораживание дрожжей

Высокая выживаемость дрожжей наблюдается при быстром их замораживании до -15
или -20° и последующем медленном, со скоростью не более 2 в минуту, охлаждении до -79°
и ниже. Влияние рентгеновского облучения проведены также на модели замороженных
дрожжевых клеток. Чувствительность дрожжевых клеток к облучению зависела от
температуры и скорости замораживания. Более высокой устойчивостью к действию рентгеновских лучей отличались дрожжевые клетки, замороженные, при температуре -10-
30°. В интервале -30-72 повышалась чувствительность к облучению (1149, 1150, 1151).
Многие склонны объяснить это образованием свободных радикалов в замороженной воде.
Замораживание при -10-30° ведет к выделению воды, а пределы клеток. Свободные
радикалы, образовавшиеся в замороженной вне клеток воде, не проникают после
оттаивания внутрь клеток и не разрушают их структуру. При быстром замораживании при
температуре -70 и ниже вода кристаллизируется непосредственно внутри клеток, поэтому
образовавшиеся под влиянием облучения свободные радикалы причиняют вред уязвимым и
жизненно важным частям клеток.

Этим, по-видимому, и объясняется тот факт, что дрожжевые клетки, быстро
замороженные при -72° и облученные при этой температуре, были так же чувствительны к
рентгеновским лучам.

Повреждения дрожжевых клеток при замораживании Содзу Хироси склонен объяснить
изменением проницаемости цитоплазматической мембраны, в результате чего лактоза и
полифосфаты проникает через нее, и расщепляются фосфатазой, находящейся за пределами
цитоплазматической мембраны. Не исключено также повреждение, цитоплазматической
мембраны кристаллами льда в результате замораживания и оттаивания (1075, 1076).

Дрожжевые клетки лучше сохраняются при быстром оттаивании. Сохраняемость
дрожжевых клеток при замораживании значительно возрастает при добавлении глицерина,
концентрация которого должна равняться приблизительно 15%.