Замораживание животных тканей и клеточных культур

Длительное сохранение жизнеспособности изолированных тканей и клеток, животных с
давних времен интересовало биологов разного профиля. Однако лишь в последнее время
эта проблема нашла свое практическое разрешение. С этой точки зрения наибольшего
внимания заслуживает методика длительного консервирования тканей, предназначенных для трансплантации и культивирования вне организма, а также сохранения ценных
штаммов перевиваемых культур клеток. Трудность использования замораживания для
сохранения жизнеспособности клеток животных обусловлена появлением внутри клеток
льда, который чаще всего приводит к разрушению и гибели последних. Сохранение нор-
мальной физиологической активности тканей в процессе замораживания и оттаивания
обеспечивается защитными жидкостями, лучшие результаты среди которых дает глицерин.
Защитное действие растворов декстрозы, сыворотки и соли более слабое, чем глицерина, в
процессе замораживания животных клеток. В последнее время в качестве стабилизаторов
при замораживании тканей стали использовать диметилсульфоксид, поливинилпирролидон, маннитол, этиленгликоль.

В настоящее время практически можно считать решенным вопрос консервирования
замораживанием ткани яичника, семенников, щитовидной и паращитовидной желез,
селезенки и костного мозга, кусочков кожи, коры надпочечников и роговицы глаза.

Большинство исследователей приходят к выводу, что жизнеспособность живых клеток
сохраняется только при медленном замораживании тканей, обработанных 15-30%-ным
глицерином. Более высокие концентрации глицерина токсически действуют на клетки при
замораживании.

Независимо от скорости замораживание без глицерина, этиленгликоля или подобных им
по действию других веществ, как правило, лишает жизнеспособности животные клетки.

Для обеспечения жизнеспособности ткани, предназначенной для трансплантации,
необходимо соблюдать следующие условия.

1. Кусочки тканей выдерживать в 15- или 30%-ном растворе глицерина на нормальной
сыворотке, растворе Тироде или физиологическом растворе хлористого натрия от
нескольких минут до 6-12 часов, что зависит от величины кусочков тканей. При этом
соблюдать все условия стерильности. После погружения кусочков ткани при 18-25° раствор
глицерина охлаждать до 2-4° со скоростью 1° в минуту.

2. Дальше, охлаждать ткани можно в защитном растворе глицерина или отдельно от него
в стерильных стеклянных сосудах с притертыми пробками. Замораживать до -16-20°
рекомендуется медленно - со скоростью не более 1° в минуту. В дальнейшем понижать
температуру быстрее - не менее 10 в минуту.

3. Температура хранения замороженной ткани не должна превышать -70°. Оптимальной
для хранения ткани считается температура в пределах -110-120.

4. Температура хранения замороженной ткани должна быть стабильной, колебания ее
не должны превышать 1-2°.

5. Сосуды с замороженной тканью должны быть герметически закрыты во избежание инфицирования и высушивания.

6. Оттаивание необходимо производить быстро, погружая сосуд с замороженной тканью в воду, подогретую до 35-40°.

Размороженную ткань освобождают от глицерина, отмывая ее в растворе Тироде,
Хэнкса, нормальной сыворотке или физиологическом растворе хлористого натрия (рН 7,2-
7,4) путем последовательного перенесения в 3-4 сосуда с небольшим количеством
указанных жидкостей.

Освобожденные от глицерина кусочки тканей используют для трансплантации.
Основным критерием оценки выживаемости животных клеток являются скорость
приживляемости трансплантатов и степень регенерации пересаженных тканей.

С познавательной и особенно с практической точки зрения исключительный интерес
представляет проблема сохранения перевиваемых и диплоидных линий клеток, поскольку
срок переживания их при положительной температуре весьма ограничен. Ряду
исследователей удавалось сохранять различные линии клеток при 4° не более 30-35 дней в
питательной среде, содержащей 10-15% сыворотки. Более длительное хранение приводило
к разрушению клеток и потере их жизнеспособности. Периодическое субкультивирование
культур клеток через каждые 4-5 недель хранения при 4° позволяет сохранять жизнеспособность перевиваемых клеточных линий до 5-7 месяцев. Однако это весьма
громоздкий и малонадежный метод длительного хранения клеточных культур.

Открытие защитного действия глицерина, диметилсульфоксида, а также маннитола
позволило разработать методы хранения культур тканей в замороженном состоянии. Сейчас
среди перечисленных препаратов наиболее широко применяется глицерин. Сочетание
обработки клеток глицерином с двухэтапным их охлаждением до -70 и -190° позволяет
сохранять жизнеспособность культур тканей от 4 месяцев до года и более.

Для замораживания клеточных культур можно использовать сухой лед со спиртом или
холодильники с программированным охлаждением до -70, -130°. Хранение
культур клеток осуществляют в смеси спирта с сухим льдом (-78°), в установках с
жидким азотом или в низкотемпературных холодильниках, обеспечивающих поддержание
температуры в пределах от -70 до -130. Для этой цели особенно удобен аппарат типа сосуда
Дьюара.

Культуры клеток обычно замораживают в обогащенных средах (в среде № 199 или среде
Игла) с 10-15% сыворотки животных и таким же количеством глицерина. Перед
замораживанием клетки снимают с матраса раствором версена, центрифугируют при 800-
1000 об/мин и осадок ресуспендируют в среде для консервации до концентрации 106,5-107
клеток в 1 мл. Взвесь клеток разливают по 1-2 мл в ампулы объемом 1,5-3 мл, которые
тотчас запаивают во избежание изменения рН среды и оставляют при комнатной
температуре на 30 минут - 1 час, с целью проникновения глицерина внутрь клеток. После
этого ампулы с клетками помещают в сосуд со спиртом и под контролем термометра вносят
кусочки сухого льда с таким расчетом, чтобы температура равномерно понижалась на 1° в
минуту.

После снижения температуры с 20 до -10-12 возможно временное обратное оттаивание,
поэтому скорость охлаждения необходимо повысить до 1,5-2 в минуту, а после достижения
-18-20° скорость охлаждения можно доводить до 5 в минуту. Хранение замороженных
клеток можно осуществлять в холодильных камерах при -70-100°, в сосудах Дьюара или в
специальных установках с жидким азотом при -196°, а также в термосах, заполненных
смесью сухого льда со спиртом, которые желательно хранить в холодильниках при -25-30°.
В термосы периодически подкладывают сухой лед для поддержания постоянной
температуры на уровне не ниже -70°. Оттаивание замороженных клеток необходимо произ-
водить очень быстро (3-5° в секунду) путем погружения ампул в водяную баню, подогретую
до 38-40°. После оттаивания ампулы с клетками центрифугируются последовательной
двукратной сменой питательной среды с целью удаления глицерина. В последние годы
для сохранения клеток при замораживании взамен глицерина стали использовать
диметилсульфоксид. Перед замораживанием клетки суспендируют в основной питательной
среде, содержащей 15% бычьей сыворотки. К этой массе добавляют 10-15% по объему
диметилсульфоксида. Замораживают и оттаивают клеточные взвеси так же, как и в среде с
глицерином. Хранят клетки при -65° и более низких температурах в течение 6 месяцев и
дольше.

О сохранении жизнеспособности клеток можно судить по их отношению к
окрашиванию трипановым синим: жизнеспособные клетки не окрашиваются, а нежиз-
неспособные легко воспринимают окраску. Для этого 1 мл суспензии клеток смешивают
с 0,5 мл 0,5%-ного раствора трипанового синего. После этого под микроскопом в
камере Горяева производится четырехкратный подсчет количества окрашенных и
неокрашенных клеток. Окончательную оценку жизнеспособности клеток дает результат
их роста и образования монослоя ин витро в питательной среде.