Методические указания к практической работе

Практическая работа

Тема занятия: «Методы исследования крови при бактериемии, сепсисе и септикопиемии»

Составила преподаватель: Якимова Л.М.

ЛышикЛ.В.

Минск.

Практическая работа №70

Тема занятия: «Методы исследования крови при бактериемии, сепсисе и септикопиемии»

Цель занятия: отработать методику микробиологической диагностики бактериемии, сепсиса и септикопиемии

Самостоятельная работа

1. Изучение схемы исследования крови прибактериемии, сепсисе и септикопиемии.

2. Приготовление двухфазной среды.

3. Изучение характера роста микроорганизмов на средах Haemoline Performance фирмы bioMеrieux

4. Приготовление мазка из культуры, выросшей на двухфазной среде, окраска его по Граму, микроскопия.

Методические указания к практической работе

Выделяют три формы инфекционного процесса, при которых возбудитель болезни циркулирует в кровеносной и лимфатической системах - бактериемия (вирусемия, паразитемия), сепсис и септикопиемия.

Под бактериемией понимают фазу патогенеза местных или общих инфекционных заболеваний, в которую возбудитель систематически проникает в кровь из локального микробного очага и циркулирует в ней более или менее длительный период времени. При бактериемии возбудитель не размножается в крови, так как кровь сохраняет свои бактерицидные свойства. Бактериемия закономерна при заболеваниях, передающихся через кровососущих насекомых (сыпной тиф, возвратный тиф, малярия и др.) и с помощью других механизмов (брюшной тиф, лептоспироз, бруцеллез, листериоз), а также может встречаться при менинго-, стафило-, стрепто- и пневмококковых инфекциях, сибирской язве, туляремии, чуме и др. Бактериемией осложняются тяжёлые формы инфекций, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами (раневая и ожоговая инфекции, пневмония, ангина, пиелит, перитонит, синусит и др.), а также травмы, хирургические вмешательства, эндоскопические процедуры, иммуносупрессивная терапия, лучевая болезнь, голодание, переутомление и др.

Сепсисом называют тяжёлое общее острое или хроническое самостоятельное (септицемия) или вторичное (септикопиемия) инфекционное заболевание, при котором кровеносная и лимфатическая системы являются единственным (септицемия) или главным (септикопиемия) местом размножения возбудителя. При септикопиемии, кроме первичного локального микробного очага, в результате генерализации которого возник сепсис, возможно образование вторичных локальных инфекционных очагов. Для сепсиса, в отличие от бактериемии, характерны постоянное и в больших количествах присутствие и размножение возбудителя в крови, утрата кровью бактерицидных свойств, характерная температурная реакция, выраженная интоксикация, склонность к образованию вторичных очагов инфекции, тахикардия, исхудание, тромбозы, отсутствие положительной динамики в первичном очаге. В зависимости от источника выделяют уросепсис, стоматогенный, раневой, ожоговый, послеродовый, генитальный, лёгочной, пупочный и другие формы сепсиса.

Этиология. Сепсис относится к полиэтиологичным заболеваниям. Чаще всего он вызывается S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, Bacteroides sp, S. pyogenes, S. pneumoniae, K. pneumoniae, Proteus sp. и др. грамотрицательными бактериями, Iersinia pestis, Candida albicans и др. Чаще из крови выделяется монокультура возбудителя, но возможны и смешанные формы. При тяжело протекающих септических состояниях в крови, кроме возбудителя, могут присутствовать представители нормальной микрофлоры. Патогенное действие указанные микроорганизмы проявляют при условии пассивного проникновения их во внутреннюю среду в больших количествах или резкого снижения защитных сил организма. Клинические данные не позволяют поставить этиологический диагноз сепсиса или септикопиемии, необходимый для назначения рациональной терапии, поскольку зависимость между клинической картиной и этиологическим агентом не выявляется.

Микробиологическая диагностика Взятие крови целесообразно осуществлять во время лихорадочного периода, до начала химиотерапии или через 12-24 часа после последнего введения препарата. Манипуляции проводят с соблюдением правил асептики и мер индивидуальной защиты, предусмотренных при работе с кровью. Используют стерильные 20-граммовые (для детей 10-граммовые) шприцы с иглами для венопункции или одноразовые системы для взятия крови. Запрещается использовать шприцы со "стерильного стола" в процедурном кабинете, проверять проходимость иглы, просасывая через нее воздух.Не следует брать кровь из сосудистых катете- ров, кроме случаев, когда предполагается инфекция катетерного происхождения. Кожу над пунктируемой веной обрабатывают 70^о спиртом, затем 5% настойкой йода и опять спиртом, во избежание раздражения кожи. Венопункцию проводят после полного высыхания дезинфектанта. Кровь берут у постели больного или в процедурном кабинете и тут же засевают на питательные среды. Рекомендуется осуществлять эту процедуру вдвоем. Один медицинский работник проводит обработку кожи больного, венопункцию и взятие крови, второй, в это время открывает над пламенем спиртовки пробки флаконов со средами, подставляет их под струю крови из шприца, обжигает горлышки флаконов и закрывает их. Для бактериологического исследования необходимо 10-20 мл крови, которую тут же засевают на питательные среды. Соотношение крови и среды должно быть не менее 1/10.Согласно отечественным нормативным документам кровь для бактериологического исследования у взрослых забирается в количестве не менее 10 мл, у детей - не менее 5 мл. Эксперты ВОЗ рекомендуют брать у взрослых не менее 10 мл крови, у детей 2-5 мл, а у новорожденных - 1-2 мл. Если предполагается проведение бактериоскопического исследования, дополнительно готовят препарат "толстая капля" и мазок. Для приготовления мазка каплю крови диаметром 2-3 мм наносят на обезжиренное предметное стекло вблизи от торца. Перед каплей крови ставят под углом 45^о стекло со шлифованным краем и плавным движением равномерно распределяют материал по поверхности. Для приготовления препарата "толстая капля" на стекло наносят каплю крови диаметром около 5 мм и распределяют ее с помощью иглы или пипетки в диск диаметром 10-15 мм. Толщина капли должна позволять видеть через нее газетный шрифт. Иногда мазок и препарат "толстая" капля готовят на одном стекле. Для этого на поверхность приготовленного как описано выше мазка до его высыхания наносят еще одну каплю крови. Она, как правило, сама растекается в правильный диск необходимой толщины. Препараты высушивают ("толстая капля" сохнет 2-3 часа) и доставляют в лабораторию с соблюдением необходимой осторожности. Мазки фиксируют смесью Никифорова и окрашивают.

Однократное исследование крови мало результативно, а в случае обнаружения условно патогенных микроорганизмов, обитающих на коже человека, без результатов повторных исследований трудно отдифференцировать истинную бактериемию от случайной контаминации. Поэтому всегда следует стремиться к проведению серии из 3 и более исследований за определенный промежуток времени. Первичный посев крови осуществляется на “двухфазную среду“или триптиказо–соевый бульон (ТСБ)) для выделения аэробов и факультативно-анаэробных микроорганизмов, а для выделения облигатно-анаэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов - на «среду для контроля стерильности» (тиогликолевая среда), бульон Шэдлера, Колумбийский бульон с добавлением 0,05% цистеина, обогащенный сердечно-мозговой бульон; для выделения грибов на жидкую среду Сабуро.

Двухфазная среда состоит из скошенного во флаконе 150 мл 1,7-2% питательного агара и 150 мл полужидкой среды, приготовленной на питательном бульоне с добавлением 15 г глюкозы и 0,15 г агара. Кровь вносят в жидкую часть среды. “Среда для контроля стерильности” готовится на основе стандартной тиогликолевой среды, к которой добавляют 15-20 г дрожжевого экстракта и 4,25-5,0 г агара на 1 литр. В качестве индикатора анаэробиоза добавляют 0,001 г резазурина, который краснеет в присутствии кислорода. В случае покраснения более 20% верхней части столбика среду регенерируют прогреванием в течение 20 минут в кипящей водяной бане. Регенерацию можно провести лишь однократно.

При использовании коммерческих флаконов посев производится согласно прилагаемой инструкции: дезинфицируют резиновую пробку флакона 70% этиловым спиртом (или заменяющим его препаратом), выдерживают 1 минуту, производят посев крови во флакон, предварительно сменив иглу шприца. При подозрении на наличие анаэробов, во избежание попадания воздуха из шприца, сначала производят посев в «анаэробный» флакон, а затем – в «аэробный». Флаконы маркируют с указанием фамилии, имени, отчества больного, даты и времени отбора пробы, и до момента доставки в лабораторию содержат в термостате или при комнатной температуре в защищённом от света месте (не в холодильнике).

Посевы крови инкубируют при 35-37 ^оС с ежедневным просмотром в течение первых 7 дней. При отсутствии видимого роста на 8- 15 сутки, соответственно, дают отрицательный ответ

Если имеется подозрение на наличие медленно растущих микроорганизмов на 8 сутки проводиться пересев на кровяной агар и селективную питательную среду. Условия культивирования определяются предполагаемым возбудителем. Инкубацию флаконов с кровью следует продолжить еще в течение 7 дней.

Флаконы с визуальной системой учета результатов просматривают не реже одного раза в сутки на наличие признаков роста. Одновременно производят перемешивание жидкой фазы и орошение твердой питательной среды.

О наличии микробного роста на питательных средах без твердой фазы свидетельствует: хлопьевидный осадок, белые крупинки или пленка на поверхности, помутнение среды, гемолиз, коагуляция бульона, газообразование.

При появлении признаков роста, следует асептически отобрать материал для приготовления мазков (для окраски по Граму, простыми и специальными методами) и посева на питательные среды. При отсутствии микроорганизмов в препарате, окрашенном по Граму, можно предположить наличие микроорганизмов, плохо или не окрашивающихся по Граму (некоторые виды грибов, кислотоустойчивые бактерии).

В соответствии с данными бактериоскопии, типом питательной среды и сроками появления роста во флаконе, производится высев на питательные среды общего и селективного назначения: кровяной агар, шоколадный агар - для выделения широкого спектра микроорганизмов; среда Эндо (среда Мак-Конки) - для обнаружения энтеробактерий и неферментирующих грамотрицательных бактерий (НГОБ); желточно-солевой агар или другие аналогичные по назначению среды для обнаружения стафилококков; анаэробный агар (агар Шедлера и другие) - для выделения анаэробных бактерий; среда Сабуро – для обнаружение грибов, а так же при необходимости и на другие питательные среды.

Посевы на кровяном агаре культивируют - при 35-37⁰С, 5-10% СО₂, в течение 24-48 часов; На шоколадном агаре - при 35-37⁰С, 5-10% СО₂, в течение 24-48часов; На среде Эндо (среде Мак-Конки) – при 35-37⁰ С в аэробных условиях, в течение 24 часов; На ЖСА - при 35-37⁰ С в аэробных условиях, в течение 24-48 часов; На среде Сабуро - при 25-30⁰ С в аэробных условиях в течение 72 часов; На анаэробном агаре - при 35-37⁰ С в анаэробных условиях в течение 7 дней.

При выделении микроорганизмов их идентифицируют и определяют чувствительность к антибактериальным препаратам.

Ряд зарубежных фирм выпускают специальные питательные среды для исследования крови. В большинстве случаев они аналогичны “двухфазной среде” и “среде для контроля стерильности”.

В зарубежной практике исследование крови на гемокультуру является одним из наиболее массовых видов лабораторных исследований. В связи с этим там уделяется большое внимание созданию автоматизированных систем для индикации микробного роста в посевах крови. Их применение позволяет ускорить получение результата и, тем самым, способствует более раннему назначению адекватной терапии. Приборы для этой цели выпускаются многими фирмами. Они отличаются друг от друга производительностью, уровнем автоматизации, но главное - способами детекции микробного роста. Детекция микробного роста может осуществляться по продукции СО₂, изменению рН, электропроводности, окислительно-восстановительного потенциала или мутности питательной среды. Одним из наиболее популярных в Европе автоматизированных бактериологических анализаторов для детекции культур крови является прибор VITAL, предлагаемый фирмой bioMerieux. Этот прибор позволяет одновременно исследовать до 1200 образцов. Проба крови, объемом 5-10 мл засевается во флакон со специальной питательной средой, обеспечивающий рост как аэробных, так и анаэробных микроорганизмов, включая медленно растущие виды со сложными пищевыми потребностями. Флакон устанавливается в блок детекции прибора и инкубируется при осторожном встряхивании. Каждые 15 минут с помощью специальной флюоресцентной технологии прибор осуществляет детекцию микробного роста по продукции СО₂, изменению рН и модификации окислительно-восстановительного потенциала среды. Информация о получении положительного сигнала отражается звуковым сигналом, выводится на монитор компъютера и дублируется внутри модуля детекции, рядом с нужным флаконом. Время детекции от 9 до 120 часов (для медленно растущих видов).

Оценка результатов

При выделении культуры условно-патогенных аэробных и анаэробных бактерий, если исключена контаминация посторонней микрофлорой во время забора, доставки и посева материала, устанавливается этиология сепсиса или бактериемии. Заключение становится более надёжным в случае повторного выделения культуры, а также выделения аналогичной культуры из первичных или вторичных локальных очагов.

Задание на дом: Уч. С.А. Павлович «Микробиология с микробиологичес-кими исследованиями» с.441 – 443 Электронный ва-риант методичес-кой разработки лабораторно-практического занятия