Методи роботи з мікроорганізмами

Вивчати морфологічні, культуральні, фізіологічні особливості мікроорганізмів, застосовувати мікроорганізми на виробництві можна за наявності чистих культур. Чиста культура – це популяція генетично споріднених клітин, одержаних із однієї батьківської клітини.

Найчастіше чисту культуру виділяють з елективних культур.

Після одержання елективної культури розпочинають виділення чистої культури. Існує декілька методів виділення чистих культур. Вони всі ґрунтуються на ізолюванні від мікробної популяції однієї клітини (однієї колонії).

Виділення чистої культури з однієї колонії. Цей метод запровадив у мікробіологічну практику німецький учений Роберт Кох. Для виділення необхідно мати три-чотири стерильні чашки Петрі, пробірки або колбочки з щільними поживними середовищами, петлю або стерильну піпетку, шпатель Дригальського, елективну культуру, пальник. Перед початком роботи стіл протерти ватним тампоном, змоченим у спирті, ретельно вимити і продезінфікувати 70 % розчином спирту руки.

Щільні поживні середовища розплавити у киплячій водяній бані, охолоджують до температури 45 – 50 °С і розлити у чашки Петрі. Для цього колбу або пробірку з середовищем взяти правою рукою, тримаючи в похилому положенні, вийняти ватну пробку. Горловину посудини обпалити у полум’ї пальника і, відкривши великим і вказівним пальцями лівої рукикришку чашки Петрі, швидко вилити розплавлене середовище (15...20 см³) так, щоб дно чашки було повністю ним покрите. Кришку відразу закрити, чашки залишити в горизонтальному положенні на столі до повного застигання середовища.

За поверхневого способу виділення аеробних мікроорганізмів краплю культури або її розбавлення нанести петлею чи піпеткою в центр застиглого середовища, трохи відкриваючи кришку чашки Петрі. Обережно розтерти її стерильним шпателем Дригальського по всій поверхні середовища в чашці, після чого цим самим шпателем із залишками матеріалу протерти поверхню середовища послідовно в другій, третій, рідше – у четвертій чашці Петрі. При цьому кришка кожної чашки має бути відкритою настільки, щоб у щілину міг пройти лише шпатель. Після закінчення роботи скляний шпатель вмістити у дезінфікувальний розчин.

Розсівати елективну культуру на поверхню поживного середовища можна і петлею (рис. 46).

Рис. 46. Розсів культури мікроорганізмів на поверхню поживного середовища: А – шпатель Дригальського; Б – розсів; В – ріст мікроорганізмів після розсіву шпателем; Г – ріст мікрорганізмів після розсіву петлею (в трьох чашках); Д – ріст мікроорганізмів після розсіву петлею (в одній чашці)

Отже, таким способом можна виділяти чисті культури виробничих дріжджів, бражки, молока, води, пива, вина, квасу, тіста, ґрунту, змивів сировини тощо, заздалегідь підготувавши розбавлення у стерильній воді або у фізіологічному розчині (0,85 %-й розчин натрію хлориду).

Після розсіву чашки Петрі підписати, перевернути догори дном, щоб утворена під кришкою конденсаційна вода не капала вниз і не розмивала ізольовані колонії. Чашки Петрі витримувати 2 – 7 діб у термостаті, оскільки швидкість росту у різних мікроорганізмів неоднакова, і щодня їх переглядати. Кожна клітина залишається на тому самому місці середовища, куди вона потрапила в момент розсіву. Тут клітини матимуть сприятливі умови для свого розвитку, починають розмножуватися й утворюють колонії, тобто виникає дуже велика кількість клітин одного виду. Колонії, що виросли, оглядають спочатку неозброєним оком, а потім за допомогою лупи і під мікроскопом.

При огляді колоній звертати увагуна форми і розміри колоній, їхнє забарвлення і забарвлення субстрату, характер поверхні колоній та їхніх країв, вид колоній та ін. Ізольовану колонію, що відрізняється від інших зовнішніми ознаками та міститься на відстані не менш як 1 см від інших колоній, відсіяти стерильною петлею в окрему пробірку з рідким середовищем або на поверхню скошеного твердого середовища.

Мікроорганізми, які належать до факультативних анаеробів, найчастіше виділяють глибинним посівом. Для цього розплавлені агаризовані поживні середовища слід розливати по 15 – 20 см³ у пробірки і простерилізувати. Безпосередньо перед виділенням чистої культури середовища в пробірках розтопити у водяній бані. Після охолодження до температури 48 – 50 °С стерильною петлею внести краплю елективної культури у першу пробірку, закрити її ватною пробкою, вміст перемішати, після чого дві-три краплі суміші перенести у другу пробірку. Потім п’ять-шість крапель з другої пробірки перенести у третю. Таким чином одержують ряд розбавлень посівного матеріалу,якийпісля переміщування між долонями обох рук стерильно виливають у чашки Петрі. Середовище з мікроорганізмами розподілити рівним шаром по дну кожної чашки і поставити на горизонтальну поверхню для застигання. При цьому працювати з агаризованими середовищами слід швидко, оскільки при температурі 40 °С вони застигають.

Для виділення анаеробних мікроорганізмів за методом Коха необхідно обмежити доступ кисню до культури. З цією метою поверхню глибинного посіву в чашці Петрі заливають стерильною сумішшю парафіну і вазеліну (1:1). Можна використовувати спеціальні стерильні трубки довжиною 20 – 30 см і діаметром 0,4 – 0,7 см, зроблені за типом піпеток Пастера. Після заповнення трубки сумішшю розбавлення накопичувальної культури і розплавленого й охолодженого поживного середовища трубку запаюють із двох сторін (з боку капіляра й у місці перетяжки). Можна залишати посівний матеріал, ретельно перемішаний з агаризованим, добре освітленим поживним середовищем, безпосередньо в звичайній пробірці. Ватяну пробку заміняють гумовою або заливають поверхню агару сумішшю парафіну і вазелінової олії. Щоб дістати вирослі колонії анаеробних мікроорганізмів, пробірки або трубки злегка нагрівають, швидко обертаючи над полум'ям пальника. Агар, що прилягає до стінок, розплавляється, і стовпчик вислизає в підготовлену стерильну чашку Петрі. Стовпчик агару розрізають стерильним ланцетом, колонії витягають стерильною петлею або стерильною капілярною трубкою і переносять у рідке середовище.