Изучите правила забора материалаи его подготовкук ПЦР.

Ориентировочная карта основ действий для учащихся на практическом занятии № 20.

Тема: «Метод молекулярной гибридизации и метод амплификации нуклеиновых кислот».

План:

1. Характеристика принципа метода молекулярной гибридизации и метода амплификации нукленовых кислот.

2.Методы детекции нуклеиновых кислот.

Самостоятельная работа:

Задание № 1.

Ознакомьтесь с инструкцией для проведения практического занятия.

Задание № 2.

Изучите принципы метода молекулярной гибридизации и метода амплификации нукленовых кислот.

Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот - это метод, основанный на соединении комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот в одну молекулу. Возможна гибридизация ДНК-ДНК и ДНК-РНК.

Принцип метода гибридизации:

Двухцепочечную ДНК разогревают в соответствующем буфере. Из-за изменения внешних условий, водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями становятся термодинамически невыгодными и цепочки расходятся.

Препарат денатурированных ДНК смешивают с другой денатурированной ДНК.

Препараты медленно охлаждают, при этом одноцепочечные ДНК отжигаются друг на друга (образуются водородные связи между комплементарными основаниями), при этом образуется «гибридная» молекула ДНК.

Принцип метода амплификации:

Амплификация- многократно повторяемое удлинение коротких синтетических олигонуклеотидов (праймеров), комплементарных заданному участку ДНК, с помощью фермента ДНК-полимеразы. В результате, даже при наличии минимального исходного количества возбудителя в результате реакции амплификации, занимающей обычно 1-2 часа, происходит накопление продукта реакции, превышающее исходное количество фрагментов генома в миллионы и миллиарды раз.

На основе методов молекулярной гибридизации и амплификации нуклеиновых кислот разработаны ПЦР, лигазная цепная реакция, амплификация с перемещением цепи ДНК (SDA) и транскрипционная амплификация (TMA).Наибольшее применение в практике имеет ПЦР.

Задание № 3.

Изучите использование ПЦР – диагностики в медицине.

За создание метода ПЦР Керри Мюллису в 1993 году была присуждена Нобелевская премия. ПЦР - диагностика является самым современным, быстрым и точным методом исследования в микробиологии для выявления многих заболеваний. ПЦР - диагностика обнаруживает наличие возбудителей в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно: выявление единичных клеток бактерий или вирусов, выделение возбудителей с высокой антигенной изменчивостью или паразитирующих внутри клетки хозяина. ПЦР используют для диагностики скрытых или хронических инфекций, передаваемых половым путем: хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, гарднереллеза, микоплазменной инфекции. С помощью ПЦР исследуются вирусы папилломы человека, гепатитов, СПИДа. Реже ПЦР - диагностика применяется для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза, дифтерии, для выявления хеликобактериоза в гастроэнтерологии, для определения цитомегаловирусной инфекции и онковирусов.

Задание № 4.

Изучите правила забора материалаи его подготовкук ПЦР.

Забор клинического материала должен производиться в пробирки с транспортной средой, предоставляемой фирмой-производителем.

Материал: слизь, моча, кровь, мокрота, кал, соскобы эпителия уретры или канала шейки матки, секрет простаты, мазки из коньюнктивы глаза и т.д.

Подготовка пробы материала (выделение ДНК или РНК) должна проводиться в условиях, исключающих перекрестное загрязнение исследуемых проб выделяемыми нуклеиновыми кислотами. Для исключения ложноположительного результата необходимо обязательное использование чистых перчаток, одноразовых пробирок и наконечников к автоматическим пипеткам, проведение предварительной ультрафиолетовой обработки помещения и рабочих поверхностей столов и приборов.

Задание № 5.

Изучите основные стадии ПЦР- диагностики:

Ход реакции

При проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий (см. Рис.1)

1 стадия - денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—98 °C на 0,5—2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК.

2 стадия - отжиг. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры (это короткие синтетические олигонуклеотиды длиной 18—30 оснований) могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Время стадии отжига — 30 cек. За это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов.

3 стадия - элонгация. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5' к 3' концу. Эта стадия длится 7—10 мин.