Спектрофотометрия в видимой и ультрафиолетовой областях

Спектр поглощения или, более корректно, абсолютный спектр поглощения вещества представляет собой зависимость количества поглощенного света от длины волны. Спектры поглощения в ультрафиолетовой (200 – 400 нм) и видимой (400 – 800) нм) областях отражают переходы связанных и несвязанных электронов в молекуле.

Это обычно делокализованные электроны двойных С=С связей и не поделенные пары азота и кислорода. Поскольку, как правило, электроны в молекуле при комнатной температуре находятся на нижнем энергетическом уровне, спектры в этой области дают информацию об основном и первом возбужденном электронных состояниях молекулы. Ввиду того, что длина волны поглощенного света соответствует определенному переходу, пики на спектрах поглощения вещества обусловлены присутствием в нем известных структур. Группа в молекуле, которая дает вклад в спектр ее поглощения, называется хромофором. Такой группой является, например, карбонильная группа > С=О. При образовании сопряженных связей в молекуле энергия возбужденного состояния электронов уменьшается, и, следовательно, хромофор начинает поглощать свет большей длины волны. Такой сдвиг в спектрах поглощения называется батохромным. Наоборот, сдвиг спектра в коротковолновую область именуется гипохромным. Гиперхромный и гипохромный эффекты – это соответственно увеличение и уменьшение экстинкции. Обнаружить расположенные очень близко линии колебательных и вращательных переходов на спектрах молекул удается лишь при высоком разрешении (разрешением называется способность прибора различить две близко расположенные линии).

Исследуемое вещество растворяют в соответствующем растворителе и помещают в оптически прозрачный сосуд для измерений – кювету. Обычно кюветодержатель имеет ячейки для четырех кювет. Для определения поглощения только исследуемого вещества используется кювета сравнения, идентичная кювете с образцом; в нее наливают контрольный раствор. Поскольку стекло поглощает ультрафиолетовый свет, для проведения измерений в этой области используют кварцевые кюветы. Для работы с летучими или химическими активными веществами кюветы закрывают пробками. Поскольку кювета, помещенная в спектрофотометр, становится составной частью его оптической системы, с ней нужно обращаться очень аккуратно. Царапины и грязь на стенках кюветы сильно рассеивают и поглощают свет, искажая результаты измерений. Об этом особенно надо помнить при работе в ультрафиолетовой области. Поскольку органические молекулы поглощают в ультрафиолетовой области, ни в коем случае нельзя касаться руками оптических стенок кюветы и вообще стараться по возможности меньше брать кюветы в руки. Раствор лучше заливать в кюветы, поставив их в предварительно вынутый из прибора кюветодержатель. Манипулируя с пипеткой, надо помнить, что кюветы довольно хрупки, особенно кварцевые, поэтому заполнять их нужно, не касаясь стенок пипеткой.

Схема работы со спектрофотометрами похожа на работу с ФЭКом, но еще раз хочется напомнить, что в отличие от ФЭКа, на спектрофотометре мы работаем с монохроматическим светом, имеем возможность работать с не окрашенными растворами и работать в разных областях спектра.

Спектры в ультрафиолетовой и видимой областях применяются для идентификации соединений, как в чистом виде, так и в составе смесей. Эта методика используется для определения химической структуры соединения и его превращения, однако, для более точного анализа необходимы исследования в инфракрасной области. Ряд важных биологических соединений можно изучать с помощью спектрофотометрии в видимой и ультрафиолетовой области. Например, измеряя поглощение белков при 280 нм, а нуклеиновых кислот при 260 нм – длинах волн, соответствующих максимуму поглощения этих соединений. Экстинкция белка при 280 нм зависит от содержания в нем ароматических аминокислот – тирозина и триптофана, – поэтому значения молярной экстинкции при 280 нм для всех белков различны, и для определения содержания каждого из них требуется индивидуальная калибровочная кривая. Как правило, биохимики работают со смесью белков, и тогда можно пользоваться градуировочной кривой, полученной для белка или смеси белков со средним содержанием тирозина и триптофана. Это может быть, например, сывороточный альбумин или смесь сывороточных белков. Таким образом, для контрольных измерений надо выбирать соответствующий белок. Проводя измерения при длинах волн, где примесь поглощает больше исследуемого вещества, можно с помощью соответствующих формул оценить количество примеси в образце. Так, пользуясь методом Мортона и Стубса, определяют содержание витамина А в смыленных экстрактах природных масел, а по соотношению экстинкции при 260 и 280 нм (280/260) находят содержание белка в препарате нуклеиновых кислот.

Количество двух компонентов, имеющих перекрывающиеся спектры, например хлорофиллы а и b в эфире, можно оценить, зная их экстинкцию при двух длинах волн. Для n компонентов надо иметь данные по поглощению при n длинах волн.