Определение белка спектрофотометрическим методом

 

Спектрофотометрический метод количественного определения белка основан на способности ароматических аминокислот (триптофана и тирозина) поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом поглощения при 280 нм. Таким образом, измеряя величину оптической плотности при этой длине волны, можно судить о количестве белка, присутствующего в данном растворе.

Определению белка данным методом мешает присутствие нуклеиновых кислот. Их влияние можно исключить, измеряя оптическую плотность не только при 280 нм, но и при 260 нм, а затем рассчитать истинное содержантие белка по номограмме (см. Г.А. Кочетов «Практическое руководство по энаимологии». – С. 227).

Спектрофотометрический метод является в некоторой степени приближенным, так как количество триптофана и тирозина у разных белков различно. Поэтому поглощение одинакового количества разных белков неодинаково. Условно можно считать, что при концентрации «усредненного» белка в растворе, равной 1 мг/мл, величина оптической плотности при 280 нм равна 1,0 (при использовании спектрофотометрической кюветы толщиной 1 см).

Несмотря на недостаточную точность, спектрофотометрический метод применяется очень широко: он быстрый, не требует каких-либо реагентов, раствор белка после измерения может быть использован для дальнейшей работы.

 

Реактивы и оборудовние

· Спектрофотометр СФ-16.

· Пробирки, пипетки.

· Сыворотка.

 

Ход работы

1. Включить спектрофотометр в сеть.
2. Поставить зеркало в блоке источника света в положение «Д».
3. В блоке стабилизатора поставить переключатель ламп в положение «Лампа дейтериевая».
4. В блоке спектрофотометра поставить переключатель фотоэлемента в положение «Ф».
5. Тумблер включения спектрофотометра поставить в положение «Накал».
6. Нажать кнопку «Высокое напряжение» и оставить спектрофотометр на 20-30 минут прогреваться.
7. Развести сыворотку в 200 раз (в мерную колбу на 100 млвнести 0,5 мл сыворотки и довести дистиллированной водой до метки).
8. Установить длину волны 280 нм.
9. Установить измерительную шкалу на «0», переключатель шкал поставить на «0-100», переключатели темнового тока и чувствительности – на «1», а ручку плавной регулировки чувствительности – в центральное положение.
10. Открыть крышку кюветной камеры, в ячейку «1» кюветодержателя поставить кювету с контролем (дистиллированной водой), а в ячейку «3» - кювету с исследуемым образцом, закрыть крышку кюветной камеры. ВНИМАНИЕ! Крышку кюветной камеры можно открывать только тогда, когда рукоятка переключателя шторки фотоэлемента находится в положении «Закр».
11. Поставить против окошка фотоэлемента ячейку «1». Вращая рукоятку плавной регулировки темнового тока, скомпенсировать темновой ток фотоэлемента (установить стрелку миллиамперметра на центральный штрих шкалы).
12. Открыть фотоэлемент, поставив рукоятку шторки переключателя в положение «Откр». Вращая рукоятку механизма изменения ширины щели, установить стрелку миллиамперметра на центральный штрих шкалы. Закрыть фотоэлемент.
13. Поставить против окошка фотоэлемента ячейку «3», открыть фотоэлемент. Установить стрелку миллиамперметра на центральный штрих шкалы, поворачивая движок отсчётного потенциометра. Закрыть фотоэлемент.
14. Снять отсчёт по шкале оптической плотности D (верхняя).
15. Рассчитать концентрацию белка в сыворотке по формуле 200*D (мг белка в мл сыворотки).и сравнить её с концентрацией белка, определённой методом Лоури.

Оптическая плотность равна:

Концентрация белка в сыворотке равна:

Контрольные вопросы

1. Принцип устройства спектрофотометра.

2. Какие из известных Вам биомолекулы можно количественно определять используя спектрофотометр не прибегая при этом к их предварительной модификации.

3. Перечислите преимущества использования спектрофотометра в биохимических исследованиях по сравнению с фотоэлектроколориметром.

 

 

 

Лабораторная работа №4

ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ

Для проведения гель-фильтрации используются гели, состоящие из гранул, в которых имеются поры определённого размера. В качестве матриц для гель-фильтрации наиболее широко используются сефадексы, биогели, трисакрилы, ультрагели. Метод основан на разнице размеров молекул белков и диаметра пор матрицы. Крупные молекулы, размеры которых превышают размеры пор, не проникают в гранулы и движутся быстрее мелких молекул, которые проникают в гранулы. Молекулы промежуточного размера проникают только в часть пор и поэтому двигаются с промежуточной скоростью. В результате молекулы элюируются из колонки вы порядке уменьшения их размеров. Прокалибровав колонку с помощью белков с известной молекулярной массой, можно определить молекулярные массы исследуемых белков. Гель-фильтрация широко используется для разделения белковых смесей, определения молекулярной массы, удаления солей (обессаливания), смены буфера.

Реактивы и оборудование.

· Сефадекс G-75.

· Раствор NaCl (9 г NaCl на 1000 мл H2O).

· Раствор гемоглобина (2 мг/мл) и рибофлавина (0,5 мг/мл).

· Колонка для гель-фильтрации (8x150 мм).

· Фотоэлектроколориметр КФК-2.

· Стаканы, пробирки, стеклянные палочки, пипетки, фитинги.

 

Ход работы

1. Приготовление геля

Сефадекс G-75 суспендируют в 5-10 кратном объёме дистиллированной воды и оставляют для набухания на 3 часа. Затем перемешивают до однородной массы, дают отстояться. После оседания основной массы геля осторожно декантируют надосадочную жидкость с неосевшими обломками гранул. Суспендирование и последующую декантацию (отмучивание) повторяют 3-4 раза. Отмучивание геля уменьшает сопротивление колонки потоку растворителя, что приводит к увеличению скорости элюции.

2. Заполнение колонки

Колонку закрепляют в вертикальном положении, закрывают нижний конец пробкой со вставленным фитингом, помещают в основание колонки кружок фильтровальной бумаги, размер которого должен точно соответствовать внутреннему размеру колонки. Заливают примерно 2 мл раствора NaCl, дают заполниться фитингу и через воронку по стенке заливают густую суспензию геля. Открывают зажим колонки и дают раствору свободно вытекать, следя за тем, чтобы над гелем оставался слой раствора NaCl. Суспензию геля прибавляют до тех пор, пока его высота в колонке не достигнет нужного уровня, верхняя поверхность геля (стартовая зона) должна быть строго горизонтальной. Затем на поверхность геля помещают кружок фильтровальной бумаги, не допуская образования воздушных пузырей. Колонку промывают (уравновешивают) 1 объёмом NaCl.

3. Разделение гемоглобина и рибофлавина.

Открывают зажим колонки и сливают столб раствора NaCl, находящийся над сефадексом. Когда нижний мениск раствора коснётся поверхности кружка фильтровальной бумаги, колонку закрывают. Осторожно с помощью шприца наносят 0,5 мл раствора гемоглобина и рибофлавина. Открывают колонку, дают образцу впитаться и затем быстро смывают остатки образца со стенок колонки тем же объёмом растворителя. Затем заполняют колонку раствором NaC, закрывают верхней пробкой с иглой и посоединяют фитингом к сосуду, из которого поступает элюирующий раствор. С момента нанесения образца на колонку собирают фракции объёмом 1 мл. Через некоторе время гемоглобин и рибофлавин разделяются на 2 зоны. Нижняя – гемоглобин движется быстрее, верхняя – рибофлавин – медленнее. Элюирование проводят до полного выхода рибофлавина. Определяют элюционный объём (Vэ) гемоглобина (Vэг) и рибофлавина (Vэр).

Для этого измеряют оптическую плотность элюата на КФК-2 при длине волны 540 нм для гемоглобина и 440 нм для рибофлавина, и складывают объёмы всех фракций, вышедших до максимума поглощения при 540 нм (для гемоглобина) и 440 нм (для рибофлавина).

 

Содержание отчёта

1. Полученные результаты оформляют в виде таблицы:

 

№ фракции	Оптическая плотность при 540 нм	Оптическая плотность при 440 нм
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.

 

2 График зависимости оптической плотности от объёма элюции для двух длин волн.

3. Значение Vэг = Vэр =

 

Контрольные вопросы

1. На каком принципе основан метод гель-фильтрации?
2. Назовите основные параметры колонки, используемой для хроматографии.
3. Каким образом определяют такие параметры колонки, как «Обьем наружный», «Обьем внутренний»?
4. От чего зависит коэффициент распределения конкретного вещества для определённого сефадекса?

 

Лабораторная работа №5