Работа № 4. Влияние активаторов и ингибиторов на активность α-амилазы слюны

Работа № 1. Денатурация белков под действием кислот и при нагревании.

Принцип метода: денатурация - это нарушение структурной организации белковой молекулы, приводящее к изменению физико-химических и биологических свойств белка. Большинство белков теряют биологическую активность в присутствии сильных минеральных и органических кислот, при обработке ПАВ, органическими растворителями, солями тяжелых металлов и под действием физических факторов (температура, ультразвук, радиация). Денатурации предшествует нарушение гидратной оболочки и снятие заряда белка, в силу чего он становится менее гидрофильным и легко осаждается.

Клинико-диагностическое значение.

Осаждение белка с помощью ТХУ широко используется в клинической практике для обнаружения белка в биологических жидкостях (моча, экссудаты и др.).

В клинической практике выполнению анализа сыворотки крови на содержание малых молекул (глюкоза, мочевая кислота и т.д.) предшествует осаждение белков действием минеральных кислот или ТХУ.

Способность белка прочно связывать ионы тяжелых металлов в виде нерастворимого осадка используется как противоядие при отравлениях солями тяжелых металлов.

Работа № 2. Обнаружение никотинамидадениндинуклеотида (НАД) в дрожжах.

Принцип метода: В процессе тканевого дыхания водород от оксиляемого субстрата с помощью ферментов дегидрогеназ переносится на коферменты ФАД или НАД+. НАД+ - кофермент, содержащий витамин РР, встречается во многих тканях и органах человека и животных, много его и в дрожках. Этот кофермент легко извлекается из дрожжей горячей водой (он термостабилен) и может быть обнаружен по образованию флуоресцирующего комплекса с ацетоном.

2. Напишите в общем виде реакцию дегидрирования субстрата с участием НАД+.

Работа № 3. Определение амилазной активности в моче (крови) методом Каравея со стойким крахмальным субстратом.

Принцип метода: α-амилаза гидролизует крахмал с образованием продуктов, не дающих цветной реакции с йодом. Об активности α-амилазы судят по уменьшению интенсивности окраски.

Нормальные значения. Сыворотка крови: 3,3-8,9 мг/(с•л), Моча: до 44 мг/(с•л).

Клинико-диагностическое значение. Повышение активности α-амилазы в крови и моче наблюдается при остром панкреатите (до 90% и более), а также при вирусном гепатите и раке поджелудочной железы. Труднообъяснимую гиперамилаземию вызывают холецистит, перитонит, ожоги, острый аппендицит. Употребление многих фармакологических препаратов (кортикостероиды, салицилаты, тетрациклин, гистамин) приводит к повышению уровня активности α-амилазы. При почечной недостаточности α-амилаза в моче отсутствует.

Работа № 1. Специфичность фермента α-амилазы.

Принцип метода: Специфичностью действия ферментов называется их способность катализировать только определенные химические реакции. Например, α-амилаза ускоряет гидролиз крахмала, но не виляет на скорость гидролиза сахарозы.

Работа № 2. Влияние рН на активность ферментов.

Принцип метода: Оптимум рН α-амилазы слюны, при котором она обладает максимальной каталитической активностью – 6,6-6,8, что соответствует значению рН в ротовой полости. Сдвиг рН в кислую или щелочную сторону приводит к инактивации фермента.

Об изменении активности слюнной α-амилазы судят качественно по уменьшению интенсивности окраски раствора после добавления йода в инкубационную среду.

Работа № 3. Влияние температуры на активность α-амилазы слюны.

Принцип метода: Температура, при которой наблюдается максимальная активность фермента называется оптимальной. Для большинства ферментов организма человека она равна 35-40°С. При более высоких температурах, как и при более низких, скорость ферментативных процессов падает.

Работа № 4. Влияние активаторов и ингибиторов на активность α-амилазы слюны.

Принцип метода: Каталитическое действие ферментов может усиливаться некоторыми веществами, которые называются активаторами. Вещества, тормозящие активность ферментов, называются ингибиторами. Часто активирующее или тормозящее действие оказывают ионы металлов.