Обезвреживание аммиака в организме

Реакции дезаминирования аминокислот и азотистых оснований, окисление биогенных аминов приводят к образованию в тканях токсичного для организма аммиака. Аммиак токсичен и его содержание в крови должно быть предельно мало, иначе возможно нарушение функции мозга и развитие комы. В растениях аммиак содержится также в незначительных количествах. В живых организмах существуют механизмы обезвреживания аммиака.

Одним из путей связывания и обезвреживания аммиака является биосинтез глутамина (возможно аспарагина).

Основной механизм обезвреживания аммиака – биосинтез мочевины. Мочевина выводится с мочой; у растений может накапливаться в заметных количествах, особенно в растениях, имеющих на корнях микоризу.

Основным местом синтеза мочевины является печень. Образование мочевины происходит в результате нескольких ферментативных реакций, которые составляют орнитиновый цикл. Г.Кребс и К.Гензеляйт впервые в 1932 г. вывели уравнения реакций синтеза мочевины (рис.21).

Образование мочевины протекает в несколько этапов. На первом этапе синтезируется макроэргическое соединение карбомоилфосфат – метаболитически активная форма аммиака, используемая в качестве исходного продукта для синтеза пиримидиновых нуклеотидов и аргинина. В настоящее время открыты три разных пути синтеза карбомоилфосфата.

Первая реакция (необратимая) идет при участии фермента –аммиакзависимой карбомоилфосфатсинтетазы:

Реакция требует затраты двух молекул АТФ, открыта в митохондриях клеток печени и используется преимущественно для синтеза аргинина и мочевины.

Вторую, также необратимую, реакцию катализирует глутаминзависимая карбомоилфосфатсинтетаза:

Реакция открыта в цитозоле клеток животных и требует наличия ионов Mg²⁺.

Третью обратимую реакцию катализирует карбаматкиназа (реакция открыта у микроорганизмов).

На втором этапе цикла мочевинообразования происходит конденсация кабомолфосфата и орнитина с образованием цитруллина; реакцию катализирует орнитин-карбомоилтранс­фераза. На следующей стадии цитруллин превращается в аргинин в результате двух последующих реакций. Первая из них – конденсация цитруллина и аспарагиновой кислоты с образованием аргининосукцината (реакцию катализирует аргининосукцинатлиаза). Аргининосукцинат распадается в следующей реакции на аргинин и фумарат при участии аргининосукцинатлиазы. На последнем этапе аргинин расщепляется на мочевину и орнитин под действием аргиназы.

На синтез одной молекулы мочевины требуется затрата четырех высокоэнергетических фосфатных групп: две молекулы АТФ расходуются на синтез карбомоилфосфата и одна - на образование аргининоянтарной кислоты, при этом АТФ расщепляется на АМФ и РР_i, который при гидролизе также образует две молекулы Р_i.

Рис. 21. Орнитиновый цикл синтеза мочевины в печени

 

В процессе эволюции живые организмы выработали различные типы азотистого обмена. Это аммониотелический тип, при котором главным конечным продуктом азотистого обмена является аммиак; он свойствен преимущественно рыбам. При уреотелическом типе обмена основным конечным продуктом обмена является мочевина; такой тип характерен для человека и животных. Урикотелический тип характерен для птиц и рептилий; главным конечным продуктом данного типа обмена является мочевая кислота.

Биосинтез белка

Фенотипические признаки любого организма проявляются в разнообразии и количестве белков, кодируемых ДНК. Передача наследственной информации (экспрессия генов) может быть выражена схемой: ДНК ® РНК ® Белок.

На первой стадии реализации генетической информации, называемой т ранскрипцией, происходит «переписывание» нуклеотидной последовательности ДНК в одноцепочечные молекулы РНК. В результате транскрипции образуются мРНК, кодирующие аминокислотные последовательности белков, а также тРНК, рРНК и другие виды РНК, выполняющие структурные, регуляторные и каталитические функции.

В основе транскрипции лежит принцип комплементарности. Транскрипция схожа с репликацией, но отличается рядом особенностей: не требует синтеза праймера, использует не всю молекулу ДНК, а только ее отдельные короткие сегменты (отдельные гены или группы генов), требует наличия только одной из цепей ДНК в качестве матрицы.

Процесс образования молекулы мРНК на матрице ДНК в прокариотических клетках представляется относительно простым. Во многих случаях первичным продуктом экспрессии гена является молекула мРНК, уже способная к функционированию. У эукариот, в связи с наличием экзонно-интронного строения генов, мРНК проходит стадию созревания – процессинга. Процессинг иРНК включает три основных процесса: 1) кэпирования – химическая модификация 5^/-концевой последовательности мРНК; 2) сплайсинга – удаление некодирующих интронных последовательностей из мРНК и сшивание образующихся экзонов; 3) полиаденилирования – химическая модификация 3^/-последовательности мРНК.

Химический смысл кэпирования сводится к присоединению остатка 7^/-метилгуанозина посредством трифосфатной группы к 5^/-концу молекулы транскрипта, метилированию 2^/-ОН-группы первого и второго нуклеотидов на 5^/-конце мРНК. Полиаденилирование 3^/-конца первичного транскрипта включает ряд стадий и участие эндонуклеазы и полиаденилатполимеразы. Эндонуклеаза расщепляет мРНК вблизи специфической сигнальной последовательности (5^/) ААУААА (3^/), отличающейся высокой консервативностью. Полиаденилатполимераза синтезирует поли-А конец (от 20 до 250 нуклеотидов) начиная с точки распада. Считается, что основное назначение 5^/-кэп и поли-А – это защита мРНК от энзиматического распада.

Второй этап реализации генетической программы – трансляция, при котором информация, закодированная в первичной структуре нуклеиновых кислот, переводится в аминокислотную последовательность синтезируемых белков. Перевод осуществляется с правилами генетического кода. Полная расшифровка генетического кода была закончена в 1966 г. М. Ниренбергом, С. Очао, Н.Г. Кораном.

Генетический код устанавливает соответствие между нуклеотидной последовательностью данной мРНК и аминокислотной последовательностью данной синтезируемой на ней полипептидной цепи. Генетический код характеризуется следующими свойствами: триплетностью, специфичностью, непрерывностью, вырожденностью, универсальностью.

Генетический код триплетен, три нуклеотидных остатка (триплет) кодируют одну аминокислоту.

Специфичность генетического кода заключается в том, что один триплет кодирует только одну аминокислоту (каждую аминокислоту кодируют только определенные кодоны).

Генетический код непрерывен, не содержит «запятых», «знаков препинания», т.е. сигналов, указывающих на конец одного кодона и начало другого. Код линейный, однонаправленный и непрерывающийся, в процессе синтеза белка последовательность мРНК считывается группами по три нуклеотида. Это свойство обеспечивает синтез точной последовательности аминокислотных остатков в молекуле белка.

Генетический код вырожден. Число кодирующих триплетов в три раза больше числа аминокислотных остатков, многие аминокислоты кодируются двумя и более кодонами. Вырожденность генетического кода проявляется в том, что для каждой аминокислоты существует более одной тРНК, и одна тРНК может взаимодействовать более чем с одним кодоном мРНК. В трехбуквенном генетическом коде наиболее важны первые буквы, тогда как третья буква часто бывает разной. В связи с преобладающей ролью первых двух букв кодонов генетический код иногда называют квазидуплетным (псевдодуплетным). Эта особенность кода позволяет использовать меньшее число тРНК: для взаимодействия с 61 кодоном достаточно 31 тРНК в цитоплазме и всего 22 тРНК в белоксинтезирующей системе митохондрий животных.

Генетический код универсален, т. е. един для всех живущих на Земле организмов – от бактерий до человека. Небольшие отличия имеются, однако, в генетическом коде митохондрий и хлоропластов.

В таблице 12 представлены последовательности триплетов всех кодонов, ответственных за включение каждой из 20 аминокислот в белковую молекулу.

 

Таблица 12

Генетический кодовый «словарь»

 

Среди 64 кодонов 61 кодируют определенную аминокислоту, а три (АУГ, УАА, УГА) являются нонсен-кодонами («бессмысленные», так как не кодируют ни одной из 20 аминокислот). Однако эти кодоны не лишены смысла, они выполняют важную функцию сигналов терминации (окончания) в синтезе полипептида в рибосомах. Первым (основным) стоп-кодоном является УАА, а на небольшом расстоянии следом за ним располагается один из других терминирующих триплетов (УГА, УАГ).

 

Этапы синтеза белка

Подробно синтез белка изучен у прокариот.

Белковый синтез (трансляция) может условно быть разделен на 5 стадий:

1. Активирование аминокислот.

2. Инициация трансляции.

3. Элонгация трансляции.

4. Терминация трансляции.

5. Постсинтетическая модификация белков.

Две стадии считаются подготовительными и завершающими (активирование аминокислот и постсинтетическая модификация) и три стадии составляют собственно трансляцию.

Активирование аминокислот. Необходимым условием синтеза белка является наличие не свободных, а активированных аминокислот со своим внутренним запасом энергии. Активизация свободных аминокислот осуществляется при помощи специфических ферментов – аминоацил-тРНК-синтетаз – в присутствии АТФ. Процесс протекает в две стадии.

В результате реакций образуется аминоацил-тРНК (аа-тРНК) и освобождается АМФ.

Процессы трансляции.

Инициация трансляции является началом синтеза белка и требует соблюдения ряда условий: наличия рибосом (70S – у прокариот или 80S – у эукариот), аа-тРНК, инициирующих кодонов в составе мРНК и белковых факторов инициации.

Синтез белка инициирует одна аминокислота – метионин. В кодовом словаре имеется только одна аминокислота для метионина, однако во всех живых организмах открыты две тРНК для метионина: одна используется при инициации синтеза белка, другая для включения метионина во внутреннюю структуру синтезируемого полипептида в стадии элонгации.

В прокариотических клетках происходит формилирование метионина (у эукариот нет). Формилирование имеет важный химический и биологический смысл: блокируя участие NH₂ группы метионина в образовании пептидной связи, он обеспечивает тем самым синтез белка в направлении NH₂ ® COOH; образовавшаяся формилметионил-тРНК, кроме того, первой связывается с определенным участком 30S субчастицы рибосомы и с мРНК.

Процесс протекает в две стадии:

 

Первую стадию катализирует метил-тРНК-синтетаза, вторую – трансформилаза.

Важную роль играют белковые факторы инициации. У прокариот открыты три таких фактора: IF-1, IF-2, IF-3. Фактор IF-2 играет центральную роль в связывании инициаторной аа-тРНК. Два других фактора, вероятно, влияют на конформацию 30S субчастицы, помогая ей связываться с тРНК^fmet, переносящий формилметионин.

В процессе инициации происходит присоединение 30S субчастицы к мРНК, узнавание инициирующего кодона АУГ и присоединение тРНК^fmet. После образования комплекса белковые факторы инициации IF-2, IF-3 покидают 30S субчастицу, уступая место 50S субчастице, присоединение которой завершает процесс сборки полной (30S) рибосомы прокариот. Объединение субчастиц приводит к формированию двух центров связывания тРНК: Р-центра (пептидильный) и А-центра (аминоацильный) (рис. 22).

Рис. 22. Процесс элонгации полипептидной цепи

 

В Р-центре идет синтез пептидной связи, а А-центр предназначен для присоединения следующей аа-тРНК.

Элонгация трансляции у бактерий обслуживается тремя белковыми факторами (EF-Tu, EF-Ts, EF-G) и может быть подразделена на три стадии. На первой стадии к А-центру рибосомы присоединяется аа-ТРНК, приносящая второй (после формилметионина) аминокислотный остаток, кодируемый вторым кодоном мРНК. Аа-тРНК закрепляется в А-центре в комплексе с белковым фактором EF-Tu и ГТФ. При участии EF-Tu осуществляется гидролиз до ГДФ и фосфата, а выделяющаяся энергия расходуются на сближение двух акцептирующи концов молекул тРНК с прикрепленными к ним аминокислотными остатками. Комплекс EF-Tu и ГТФ при этом покидает рибосому и регенерирует с участием фактора EF-Ts,так что фактор EF-Tu вновь оказывается связанным с молекулой ГТФ, а затем и со следующей молекулой аа-тРНК.

На следующей стадии элонгации – транспептидирования – первый (формилметиониновый) остаток переносится на свободную NH₂-группу второго аминокислотного остатка, связанного с тРНК, распложенного в А-центре рибосомы. В результате образуется (в А-центре) первая пептидная связь в молекуле синтезированного белка и возникает дипептидил-тРНК. тРНК^fmet высвобождается в цитозоль. Р-центр остается свободным (вакантным). Третья стадия - транслокация – заключается в том, что дипептидил-тРНК перемещается из А-центра в Р-ценр рибосомы, одновременно с продвижением транслируемой мРНК через рибосому. А-центр, необходимый для связывания следующей аа-тРНК, освобождается. Транслокация идет в направлении 5^/ ® 3^/ и осуществляется строго на расстояние, соответствующее размеру одного триплета в мРНК. Транслокация у бактерий идет с участием фактора EF-G и сопровождается синтезом еще одной молекулы ГТФ.

Элонгация, таким образом, обеспечивает удлинение полипептидной цепи в соответствии с кодом белкового синтеза.

Терминация трансляции у бактерий связана с функционированием трех белковых факторов: RF-1, RF-2, RF-3, распознающих «бессмысленные» стоп-кодоны в мРНК. Фактор RF-1 узнает кодоны УАГ и УАА, а фактор RF-2 – кодоны УАА и УГА. Фактор RF-3 выполняет вспомогательную роль, стимулируя работу RF -1 и RF-2. При поступлении в рибосому одного из терминирующих кодонов с ним немедленно связывается соответствующий RF-фактор и тем самым блокирует присоединение аа-тРНК. Присоединение факторов терминации стимулирует пептидилтрансферазную активность в рибосоме, которая приводит к гидролизу сложноэфирной связи между С-концом синтезированного полипептида и акцептирующим концом тРНК. В результате синтезированный белок отделяется от рибосомы; одновременно отделяется тРНК и мРНК, а сама рибосома диссоциирует на 30S и 50S-субчастицы.

Постсинтетическая модификация белков. На последней стадии синтеза белка происходит формирование третичной структуры и процессинг молекулы полипептида (ассоциация мономеров с образованием олигомеров, химические превращения и т.д.).

В клетках эукариот этапы биосинтеза белка в основном соответствуют таковым у прокариот, однако представляют собой более тонко организованный процесс, связанный с особенностью организации их мРНК и иным набором белковых факторов трансляции.

Регуляция синтеза белка

Прокариоты и эукариоты способны осуществлять дифференциальную регуляцию экспрессии генов. Контроль осуществляется за тем, каким генам экспрессироваться, а каким – нет, а также регулируется уровень экспрессии различных генов. Регулироваться может какой-то один или несколько отдельных этапов считывания генетической информации при биосинтезе белка.

Регуляция синтеза белка у прокариот. Общую теорию регуляции синтеза белка разработали французские ученые, лауреаты Нобелевской премии Ф. Жакоб и Ж. Моно. Сущность этой теории сводится к «выключению» и «включению» генов как функциональных единиц (рис. 23).

Согласно теории Ф. Жакоба и Ж. Моно, в биосинтезе белка у бактерий (E. сoli) участвуют, по крайней мере, три типа генов: структурные, ген-регулятор и ген-оператор. Синтез мРНК на структурных генах молекулы ДНК непосредственно контролируется определенным участком, называемым геном-оператором. Ген-оператор локализован на крайнем отрезке структурного гена (структурных генов), регулируемого им. «Считывание» генетического кода, т.е. формирование мРНК, начинается с промотора – участка ДНК, расположенного рядом с геном-оператором и являющегося точкой инициации для синтеза мРНК. Синтезированную молекулу мРНК, кодирующую синтез нескольких разных белков, называют полицистронным (полигенным) транскриптом. Координированный одним оператором одиночный ген или группа генов образует оперон. Деятельность оперона находится под контролирующим влиянием гена-регулятора. Структурные гены и ген-регулятор расположены в разных участках цепи ДНК, поэтому связь между ними осуществляется при помощи белка-репрессора. Репрессор имеет сродство к гену-оператору и обратимо связывается с ним в комплекс. Образование такого комплекса приводит к блокированию синтеза мРНК и, следовательно, синтеза белка (т.е. функция гена-герулятора состоит в том, чтобы через белок-репрессор прекращать (запрещать) деятельность структурных генов, синтезирующих мРНК). Репрессор, кроме того, обладает способностью строго специфично связываться с определенными низкомолекулярными веществами, называемыми индукторами, или эффекторами. Если такой индуктор соединяется с репрессором, то последний теряет способность связываться с геном-оператором, который, таким образом выходит из под контроля гена-регулятора, и начинается синтез мРНК.

Эукариотические клетки обладают более сложными механизмами регуляции белкового синтеза, так как процессы транскрипции и трансляции разделены не только пространственно ядерной биомембраной, но и во времени. Эта регуляция базируется минимум на шести уровнях сложных биологических процессов, определяющих скорость синтеза и распада генетического продукта (рис. 24).

Для большинства экариотических клеток, как и клеток прокариот, стадия инициации транскрипции является основной. Тем не менее, имеются существенные различия: во-первых, место транскрипции (в ядре) и трансляции (в цитоплазме); во-вторых, активирование транскрипции у эукариот связано с множеством сложных изменений структуры хроматина в транскрибируемой области; в-третьих, в эукариотических клетках положительные регуляторные механизмы превалируют над отрицательными.

Рис.24. Регуляция экспрессии гена у эукариот

Вопросы и задачи

1. Чем определяется биологическая ценность белков?

2. Какие ферменты катализируют разрыв пептидных связей?

3. Как используются всосавшиеся аминокислоты?

4. Напишите реакцию трансаминирования между аспрагиновой и a-кетоглутаровой кислотами, дайте название фермента.

5. Назовите пути связывания и обезвреживания аммиака в организме.

6. В каком органе синтезируется мочевина?

7. Что такое генетический код и каковы его свойства?

8. Охарактеризуйте этапы синтеза белка.

9. Как осуществляется контроль регуляции синтеза белка?

Рекомендуемая литература

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. – М.: Медицина, 1998. – 704 с.

2. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. – Пер. с англ. – М.: Мир, 2002. – 589 с.

3. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика: Учеб. пособие. – Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та: Сиб. унив. изд-во, 2002. – 459 с.

4. Коничев А.С. Молекулярная биология: Учеб. для студ. пед. вузов/ А.С. Коничев, Г.А. Севастьянова. – М.: Изд. центр «Академия», 2003. – 400 с.

5. Максимов Г.В., Степанов В.И., Василенко В.Л. Сборник задач по генетике: Учеб. пособие.– М.: Вузовская книга, 2001. – 136 с.

6. Сингер М., Берг П. Гены и геномы: В 2 т. – Т. 1. Пер. с англ. – М.: Мир, 1998. – 373 с.

7. Эллиот В. Биохимия и молекулярная биология / В.Эллиот, Д. Эллиот; Под ред. А.И. Арчакова, М.П. Кирпичникова, А.Е. Медведева, В.П. Скулачева. – Пер. с англ. О.В. Добрыниной, И.С. Севериной, Е.Д. Скоцеляс и др. – М.: МАИК «Наука/ Интерпериодика», 2002. – 446 с.

 

ГЛАВА 11. ОБМЕН УГЛЕВОДОВ