Иммуноферментный анализ и его использование

В ветеринарии

 

Для диагностики инфекционных болезней животных применяются различные методы исследований, в том числе серологические и иммунохимические, основанные на реакции антиген-антитело. Главным компонентом иммунохимической реакции являются антитела (иммуноглобулины) – белки сыворотки крови, которые синтезируются в организме как проявление защитной реакции при попадании чужеродного вещества – антигена. Антитела представляют собой крупные белковые молекулы, состоящие из двух легких (L) и двух тяжелых (H) полипептидных цепей с Мм 22000 и 50000-70000 Да соответственно. Различают 5 классов иммуноглобулинов IgM, IgG, IgA, IgD, IgE, которые отличаются по Мм, размерам Н-цепей, последовательности аминокислот, углеводными компонентами, положению и количеству дисульфидных связей. Все γ-глобулины (антитела) имеют вариабельные участки – активные центры антител. Одна молекула антител может иметь несколько активных центров, способных специфически связываться с антигеном. Активный центр имеет уникальную специфичность, обеспечивающую тесную связь с антигеном, напоминающий соответствие между рукой и перчаткой, или ключом и замком.

В качестве антигенов могут выступать белки, полисахариды, а также низкомолекулярные соединения: антибиотики, пестициды. Антитела образуются не против всей молекулы чужеродного белка, а только к небольшим участкам на их поверхности – антигенным детерминантам. Антигенными детерминантами белковых молекул чаще всего являются лишь около 5 аминокислотных остатков, а в случае бактериальных клеток в качестве антигенных детерминант выступают короткие цепи из 3-5 остатков сахаров, образующих стенки бактериальных клеток. Низкомолекулярные соединения (гаптены) могут образовать антитела лишь после соединения с макромолекулами.

Для получения специфических иммуноглобулинов (антител) применяются различные методы иммунизации мелких (мыши, морские свинки, кролики, куры) и крупных (овцы, козы, лошади) животных. Принципиально новый метод получения антител – это метод гибридом.

Для диагностики инфекционных болезней разработаны высокочувствительные методы – радиоиммунный и иммуноферментный. Радиоиммунный метод требует сложной аппаратуры, радиоактивных соединений, в частности J¹²⁵, что связано с рядом ограничений, а потому неприемлим в обычных условиях.

Иммуноферментный метод не уступает по чувствительности радиоиммунному, может использоваться в различных лабораторных условиях, а некоторые варианты его могут быть применены непосредственно в условиях животноводческих ферм, например, для определения беременности у коров по уровню содержания прогестерона в молоке. Иммуноферментный метод анализа позволяет определить до 10^-14 моля вещества. Принцип метода заключается в том, что при взаимодействии антигена с антителом получается комплекс антиген-антитело. Количество антигена или антитела, вошедшее в комплекс антиген-антитело, может быть определено с помощью фермента, использованного для мечения антигена или антитела в зависимости от поставленной задачи. Сейчас разработаны сотни различных вариантов иммуноферментного анализа на твердом носителе. В этом случае антитела, иммобилизованные на твердой фазе (на иммунологических планшетах из полистирола), реагируют вначале с искомым антигеном (немеченым), а затем остающиеся свободными иммобилизованные антитела связываются с меченным (ферментом) антигеном. Количество связанного с меченным ферментом антигена обнаруживают с помощью соответствующего субстрата. Здесь фермент играет роль маркера, и использование его основано на том, что одна молекула фермента производит много молекул продуктов ферментативной реакции, концентрацию которых можно обнаружить обычными физико-химическими методами или же визуально (по изменению цвета). Иммуноферментный метод используют для выявления иммуноглобулинов, гормонов, вирусных и бактериальных антигенов, лекарственных препаратов, пестицидов и т.д.

Для диагностики инфекционных болезней животных разработаны специальные наборы для диагностики классической чумы свиней, бруцеллеза крупного рогатого скота, бешенства, сибирской язвы, хламидийной инфекции, ротавирусов, инфекционного ринотрахеита и ряда других болезней сельскохозяйственных животных. Использование моноклональных антител делает иммуноферментный анализ еще более ценным, так как при этом в несколько раз повышается его чувствительность и специфичность.

 

ХИМИЯ ВИТАМИНОВ

 

Кроме белков, жиров и углеводов, составляющих основу клеток и тканей, некоторых азотистых и безазотистых органических веществ, накапливающихся в тканях животного при метаболизме, минеральных элементов, играющих существенную роль в жизнедеятельности организма, в нем постоянно присутствуют особо активные, жизненно необходимые вещества – витамины, которые содержатся в очень малых количествах. Витамины не пластический и не энергетический материал, но недостаток или избыток их вызывает глубокие изменения в метаболизме. Они выполняют в организме функции катализаторов.

Витамины – низкомолекулярные органические вещества, выполняющие функции биологических катализаторов самостоятельно или в составе ферментов. Сейчас известно, что многие витамины функцию катализа выполняют в составе ферментов (кофакторы). Большинство витаминов в организме не синтезируются или образуются в таких количествах, которые не обеспечивают потребности организма. Источником витаминов для животных являются преимущественно корма растительного и в меньшей мере бактериального и животного происхождения.

Витамины – вещества нестойкие, они легко разрушаются высокой температурой, действием окислителей и другими факторами. При отсутствии в кормах витаминов развиваются заболевания – авитаминозы, а при недостатке в рационе – гиповитаминозы. В животноводстве явление гиповитаминозов встречается часто. Различают также гипервитаминозы, когда заболевание вызвано избыточным количеством витаминов; в животноводстве это явление не типичное, а в медицинской практике может быть как результат избыточного применения витаминных препаратов. Практически встречаются полигипо(а)витаминозы – отсутствие или недостаток не одного, а нескольких витаминов. Главные причины авитаминозов:

1. Отсутствие или недостаток витаминов в желудочно-кишечном тракте.

2. Наличие в кормах антибиотиков и сульфаниламидных препаратов, которые подавляют кишечную микрофлору, вырабатывающую некоторые витамины.

3. Физиологическое состояние организма – беременность, острые и хронические заболевания, тяжелая работа, рост и развитие молодняка, при котором повышается потребность в витаминах. При высокой продуктивности (молочная, мясная, яичная) необходимо повышенное потребление витаминов.

4. Наличие антивитаминов может также привести к а- или гиповитаминозам. Антивитамины близки по структуре к соответствующим витаминам и, включаясь в обменные реакции, ведут к нарушениям нормального течения метаболических реакций. Например, дикумарол является антивитамином для витамина К; сульфаниламидные препараты – для п-аминобензойной кислоты; аминоптерин – для фолиевой кислоты; дезоксипиридоксин – для витамин B₆; пиритиамин – для тиамина (B₁); пиридин-3-сульфокислота – для амида никотиновой кислоты.

Авитаминозы, как правило, проявляются неспецифическими признаками отсутствия или недостатка в корме соответствующего витамина. При этом отмечается общая слабость, отставание в росте и развитии молодняка, низкая продуктивность, пониженная сопротивляемость к вредным факторам среды.

История. В 1882 г. японский врач Такаки сделал интересное наблюдение над экипажами двух кораблей (300 человек). В период 9 месячного плавания один экипаж получал обычное питание, принятое на флоте, а второй – дополнительно еще свежие овощи. Оказалось, что из экипажа 1-го корабля за время плавания заболело болезнью бери-бери (недостаток тиамина (B₁) 170 человек, из них умерло 25.

Из экипажа второго корабля легкая форма заболевания возникла только у 14 человек. Он сделал заключение, что в свежих овощах содержатся какие-то вещества, необходимые для жизнедеятельности организма.

В 1896 г. голландец Эйкман, работавший тюремным врачом на о. Ява (Индонезия), где основным продуктом питания был полированный рис, заметил, что у кур, получавших полированный рис, развивалось заболевание, аналогичное бери-бери у человека. Когда Эйкман переводил кур на питание неочищенным рисом наступало выздоровление. На основании этих данных он пришел к выводу, что в оболочке риса (рисовых отрубях) содержится какое-то вещество, дающее лечебный эффект. Действительно, экстракт, приготовленный из шелухи риса, оказывал лечебное действие на людей, больных бери-бери.

Развитие учения о витаминах связано с работами отечественного врача Н.И. Лунина (1880 г.). Он пришел к заключению, что кроме белка (казеина), жиров, молочного сахара, солей и воды животные нуждаются в каких-то еще неизвестных веществах, незаменимых для питания. Это важное научное открытие в дальнейшем было подтверждено в работах К.А. Сосина (1890 г.), Гопкинса (1906 г.), Функа (1912 г.). Функ в 1912 году выделил из экстрактов оболочек риса кристаллическое вещество, предохраняющее от болезни бери-бери, и дал название витамин (vita - жизнь, amin - органическое вещество, содержащий амин). В настоящее время известно более 30 витаминов. Изучение их химической природы показало, что большинство из них не содержат азота или аминогруппы в своей молекуле. Однако термин "витамины" сохраняется и принят в литературе.

Таким образом, витамины – пищевые факторы, которые присутствуют в небольших количествах в пище, обеспечивают нормальное протекание биологических и физиологических процессов путем участия в регуляции обмена целостного организма.