Альбумины и глобулины в природных белках

ПРЕДИСЛОВИЕ

 

Практические лабораторные занятия являются необходимым дополнением теоретического курса «Биохимия» и проведение их должно способствовать лучшему усвоению курса и овладению новыми совершенными методами биохимических анализов сырья и продуктов животного происхождения.

Краткие теоретические сведения и подробное описание хода проведения работы имеют целью помочь студенту самостоятельно выполнить каждое практическое занятие.

При проведении лабораторных работ необходимо, чтобы студент отмечал в рабочей тетради все получающиеся в ходе анализов результаты.

 

I. ХИМИЯ БЕЛКОВ

Белки - важнейшая и необходимая составная часть всех живых клеток и организмов. Они составляют главную массу сухого вещества тканей человека и почти всех животных.

Это очень сложные, высокомолекулярные соединения, находящиеся в организме в коллоидном состоянии. Молекула белка состоит из остатков аминокислот, соединённых между собой пептидными связями. Под действием специфических ферментов, а также при нагревании с кислотами или щелочами белки подвергаются гидролизу (распаду с присоединением элементов воды), давая ряд промежуточных продуктов (пептоны, пептиды), а при полном гидролизе – аминокислоты.

Обладая одновременно кислым карбоксильными и основными аминными группами, белки являются амфотерными веществами и могут вести себя, как и кислоты, и как основания. При определённом рН, характерном для каждого белка, диссоциация кислых и щелочных групп белковой частицы уравнивается, и заряд амфотерного иона белка становится минимальным. Такое рН раствора носит название изоэлектрической точки белка. В изоэлектрической точке белок наименее устойчив в растворе.

Структура белковой молекулы очень лабильна и даже мягкая обработка может привести к денатурации белка, в результате которой изменяются его биологические и физико-химические свойства.

Реакции на присутствие белка основаны на открытии в нём тех или иных химических групп и на его физико-химических свойствах.

Некоторые реакции присущи не только белкам, но и другим веществам, содержащим те же группы. Так, ряд цветных реакций на белок является по существу реакциями на ту или иную аминокислоту, входящую в состав белка. Поэтому, для установления наличия белка недостаточно какой-нибудь одной реакции.

Белки разделяют на две группы: протеины, или простые белки, не содержащие небелковых групп, и протеиды, или сложные белки, содержащие помимо собственно белка, ещё и небелковую (простетическую) группу.

Среди простых белков животного происхождения чаще всего приходится встречаться с альбуминами и глобулинами.

Альбумины растворимы в воде, осаждаются при насыщении раствора сернокислым аммонием, обычно не содержат аминокислоты – глицина. Примерами альбуминов являются альбумины кровяной сыворотки, молока, яичного белка, альбумины мышц (миогены).

Глобулины не растворимы в чистой воде, но растворимы в присутствии в ней нейтральных солей; осаждаются в полунасыщенном растворе сернокислого аммония, т.е. при добавление к раствору белка равного объёма насыщенного раствора этой соли. К глобулинам относят глобулины сыворотки крови и молока, куриного яйца, мышечные глобулины (миозин, глобулин Х).

Среди сложных белков следует отметить: хромопротеиды – соединения белка с пигментом, например, гемоглобин; нуклеопротеиды – соединения белка с нуклеиновыми кислотами; фосфопротеиды – белки, содержащие фосфор, например казеин, мукопротеиды (глюкопротеиды)- соединение белка со сложными углеводами – мукополисахаридами, например муцин слюны (простые углеводные группировки содержатся во многих белках).

 

РАБОТА №1

АЛЬБУМИНЫ И ГЛОБУЛИНЫ В ПРИРОДНЫХ БЕЛКАХ

Альбумины и глобулины могут быть разделены, поскольку альбумины растворимы в воде, а глобулины – только в слабых растворах солей, а в крепких растворах (например, полунасыщенном растворе (NН₄)₂SO₄ осаждаются).

а) К яичному белку (содержащему 2 белковых вещества – альбумины и глобулин) – прибавить двойной и тройной объём дистиллированной воды и перемешать; через несколько минут выпадает осадок глобулина (альбумин остаётся в растворе). Мутную жидкость разделить на две части. К первой части прибавить немного обычной соли – раствор сделается прозрачным (растворение глобулина в солевом растворе); прибавить много соли – до насыщения, раствор опять сделается мутным – осаждение глобулина насыщенным раствором соли.

Вторую часть профильтровать: прозрачный фильтрат, содержащий альбумин, приливая по стенке пробирки наслоить на крепкую НNO3 - на месте соприкосновения жидкостей получится белый осадок альбумина.

б) Мышечные белки. Мышцы содержат белки растворяющиеся в воде или очень слабых растворах солей – миоальбумины и миогены и белки типа глубулинов, например, миозин, актомиозин и др.

Мышечную кашицу, полученную измельчением мышцы какой-либо рыбы 5-10 г, растирают с 4-5 кратным количеством воды – в воде будут находится миоальбумины и сходные с ним белки. Отфильтрованный осадок смешивают с 4-5 кратным количеством 0,6 – молярного раствора КСl и растирают в ступке 10-20 минут; в раствор переходит миозин.

Тот и другой белковой экстракт разливают по пробиркам и прибавляют по каплям 0,5% раствор уксуснокислого свинца. Появляются осадки. Заметить, чего в мышце больше – миоальбумина или миозина.

Примечание. Если экстрагировать мышцу 0,5 молярным раствором НСl

не 20 минут, а сутки – в раствор перейдёт более сложный глобулин – актомиозин.

РАБОТА № 2

ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ

Присутствие белка можно обнаружить рядом цветных реакций. Эти реакции свойственны составным частям белка – аминокислотам или образуемым ими группировкам. Так, полипептиды, а также все пептоны и белки дают биуретовую реакцию, характерную для наличия пептидных связей. Все аминокислоты, полипептиды и белки дают окрашивание (обычно фиолетовое) при нагревании с нингидрином.

Некоторые аминокислоты (тирозин, триптофан, фенилаланин, цистин, аргинин, гистидин) и их остатки (например, в молекуле белка) дают характерные цветные реакции.

В большинстве белков при помощи чувствительных реакций можно обнаружить углеводные компоненты.

 

1. Биуретовая реакция

В щелочной среде в присутствии солей меди белки дают фиолетовое окрашивание. Окраску дает комплексное соединение меди с пептидными группами: -СО – NH -.

Биуретовая реакция получается также с продуктами неполного гидролиза белка – пептонами и полипептидами.

Свое название биуретовая реакция получила от производного мочевины – биурета, который дает эту реакцию. Биурет образуется при нагревании мочевины с отщеплением от нее аммиака.

 

NH₂ NH₂

C = O C = O

NH H NH₂ +

NH₂ NH

 

C = O C = O

NH₂ NH₂ Биурет

Биуретовая реакция получается также с некоторыми немногочисленными соединениями, не содержащими пептидных групп(например, при наличии в молекуле групп –СS – NH- или =СН- NH-).

Биуретовую реакцию дают: аминокислота гистидин и амид аспарагиновой кислоты – асапарагин.

N – C – CH₂ – CH – COOH CONH₂

‖ ‖ ½ ½

HC CH NH₂ CH₂

½

NH Гистидин CHNH₂

½

COOH Аспарегин

Проделывают биуретовую реакцию с биуретом, который предварительно получают из мочевины, а затем с белком.

1. Помещают в сухую пробирку несколько кристалликов мочевины и нагревают на слабом огне. Мочевина сначала плавится. Когда сплавленная масса начнет твердеть, нагревание прекращают и дают пробирке остыть. В результате нагревания из мочевины образуется биурет, а аммиак улетучивается (об этом узнают по запаху).

2. К полученному в пробирке биурету прибавляют около 1 мл 20% раствора сернокислой меди. При встряхивании получается характерное розовато-фиолетовое окрашивание. Необходимо избегать прибавления избытка раствора сернокислой меди, так как голубая окраска получающегося гидрата окиси меди может маскировать реакцию.

3. Проделывают биуретовую реакцию с раствором белка. В пробирку наливают около 1 мл раствора белка, 1-2 мл раствора едкого натра и 1-2 капли раствора сернокислой меди. При взбалтывании появляется розовато – фиолетовое окрашивание.

 

2. Нингидриновая реакция

Белки, а еще в более сильной степени аминокислоты и полипетиды дают синее или фиолетовое окрашивание с нингидрином. Нингидриновая реакция характерна для аминогруппы в α-положении.

 

 

С=О Нингидрин

С=О·Н₂О (трикетогидрин-

денгидрат)

С=О

1. Проделывают реакцию с какой-нибудь аминокислотой, например с глицином. Наливают в пробирку около 1 мл раствора глицина, добавляют 5-6 капель слабого (0,1%) раствора нингидрина и нагревают. Появляется фиолетово-синее окрашивание.

2. Так же производят нингидриновую реакцию с 1-2 мл раствора белка, взяв 0,3-0,5 мл раствора нингидрина. Получается фиолетовое (иногда фиолетово-розовое окрашивание); С течением времени раствор синеет.

 

3. Ксантопротеиновая реакция.

Подавляющее большинство белков при нагревании с крепкой азотной кислотой дает желтое окрашивание, переходящее в оранжевое при добавлении щелочи или аммиака. По-гречески «ксантос» - желтый, откуда реакция и получила название ксантопротеиновой. Такое желтое окрашивание можно наблюдать при попадании крепкой азотной кислоты на кожу, ногти, шерсть и т.п. Эта реакция характерна для бензольного ядра циклических аминокислот (тирозина и триптофана), которые содержатся почти во всех белках. При действии крепкой азотной кислоты на эти аминокислоты происходит нитрование бензольного кольца с образованием нитросоединений желтого цвета.

Ксантопротеиновую реакцию, помимо белков, дают многие более простые ароматические соединения (например, фенол).

1. Проделывают реакцию сначала с фенолом (карболовой кислотой). Наливают в пробирку около 1 мл раствора карболовой кислоты и прибавляют около 1 мл концентрированной азотной кислоты. При нагревании (осторожно!) появляется желтое окрашивание.

2. Проделывают ксантопротеиновую реакцию с раствором белка. Наливают в пробирку около 1 мл раствора белка и прибавляют 5-6 капель концентрированной азотной кислоты. Появляется осадок свернувшегося (под влиянием кислоты) белка, который и окрашивается при подогревании (осторожно!) в желтый цвет.

Дают пробирке охладиться и осторожно прибавляют избыток аммиака или едкого натра. Желтая окраска при подщелачивания переходит в оранжевую.

 

4. Реакция Милона.

Фенолы, например, карболовая кислота, и их производные дают ртутные соединения красного цвета. Эти соединения получаются при нагревании со специально приготовленным раствором ртути в азотной кислоте, содержащей азотистую кислоту.

Большинство белков дает миллонову реакцию, так как в их состав входит аминокислота тирозин, являющийся одновременно фенолом.

 

СН₂ – СН – СООН

NН₂

Тирозин

 

 

ОН

 

1. Сначала проделывают реакцию с карболовой кислотой (фенолом). Наливают в пробирку около 1-2 мл раствора карболовой кислоты, прибавляют около 0,5 мл реактива Миллона и осторожно нагревают. Появляется розовое окрашивание.

2. Проводят милонову реакцию с раствором белка. В пробирку наливают 1-2 мл раствора белка и прибавляют 5-6 капель реактива Миллона. Появляется осадок свернувшегося белка, так как реактив Миллона содержит соли ртути и азотную кислоту. Содержимое пробирки осторожно нагревают. Осадок окрашивается в кирпично-красный цвет.

Следует избегать прибавления избытка реактива Миллона, так как этот реактив содержит азотную кислоту, которая может дать желтое окрашивание (ксантопротеиновую реакцию), маскирующее реакцию Миллона.

3. Проделывают аналогичным образом миллонову реакцию с раствором желатины. Если желатина достаточно чиста, реакция не получается, так как а молекуле желатина остаток тирозина отсутствует.

 

5. Реакция Адамкевича

При прибавлении к белку нескольких капель глиоксиловой кислоты

О О

/ Н – С – С – Н/ - на границе с крепкой серной кислотой получается

красно-фиолетовое окрашивание. Эта реакция зависит от присутствия в молекуле белка триптофана.

 

СН

 

НС С С – СН₂ – СН – СООН

НС

‖ |

С СН NH₂

СН NH Триптофан

 

Наливают в пробирку несколько капель белка, прибавляют около 1 мл концентрированной уксусной кислоты и, сильно наклонив пробирку, очень осторожно, по стенке, подслаивают около 1 мл концентрированной серной кислоты так, чтобы обе жидкости не смещались. При стоянии на границе двух жидкостей получается красно-фиолетовый кружок (кольцо).

 

6. Реакция на серу (цистина и цистеина) в белках

В состав молекулы большинства белков входят содержащие серу аминокислоты – цистин и цистеин.

 

CH₂ – S – S – CH₂ CH₂ – SH

| | |

HC – NH₂ HC – NH₂ CH – NH₂

| | |

COOH COOH COOH

Цистин Цистеин

 

Под действием щёлочи эти аминокислоты легко отщепляют серу в виде сероводорода. Поэтому почти все белки дают положительную реакцию на слабо связанную серу.

Реакция состоит в том, что при кипячении белка с крепкой едкой щёлочью и уксусно-свинцовой солью раствор начинает темнеть. Едкая щёлочь разрушает цистин и цистеин и отщепляет серу от белка в виде сероводорода, который со свинцовой солью даёт чёрный осадок сернистого свинца.

Наливают в пробирку около 1 мл 10% раствора уксуснокислого свинца и понемногу прибавляют раствор едкого натра до растворения образовавшегося осадка гидроокиси свинца. Приливают несколько капель белка и смесь осторожно нагревают. Раствор начинает темнеть.

 

7. Реакция на остаток аргинина

Белки дают красное окрашивание с гипобромитом (или гипохлоритом) и α- нафтолом в щелочной среде. Окраска зависит от наличия в молекуле белка остатка аминокислоты аргинина.

 

NH₂ NH – CH₂ – CH₂ – CH₂ – CH – COOH

|

C NH₂

NH Аргинин

 

1. В пробирку наливают 1-2 мл раствора белка. Добавляют 1-2 капли 10% раствора едкого натра и 1-2 капли раствора α- нафтола (0,02%).

2. Перемешивают содержимое пробирки и прибавляют каплю гибобромита (NaBrO). Появляется малиново-красное окрашивание.

3. Таким же образом проделывают реакцию с раствором аргинина. Получается окраска кирпично-красного оттенка.

8. Диазореакция

Белки дают оранжево-красное окрашивание с диазореактивом. Окраска зависит от образования окрашенных азосоединений с остатками аминокислот – тирозина, триптофана и гистидина, входящих в состав белковой молекулы. Диазореакция используется для качественного и количественного определения тирозина и гистидина в белковых гидролизатах и других объектах.

1. Наливают в пробирку 1-2 мл раствора тирозина, 0,3-0,5 раствора соды и около 1 мл диазореактива. Появляется оранжево-красное окрашивание.

2. Проделывают ту же реакцию с раствором белка, беря его вместо раствора тирозина. Получается оранжево-красное окрашивание.

 

9. Реакция на присутствие углеводных компонентов

Почти все белки содержат в своём составе углеводные компоненты. Благодаря этому большинства белков, как показали Баллас и Подобедов, в присутствии концентрированной серной кислоты дают характерное для углеводов фиолетовое окрашивание с α–нафтолом (реакция Молиша) или красное окрашивание с тимолом. Окраску с нафтолом или тимолом дают фурфурол и его производные, которые образуются из углеводов под действием концентрированной серной кислоты.

НС СН О

НС С – С

Н

О Фурфурол

 

1. Наливают в 2 пробирки по 1-2 мл раствора сахара, добавляют в первую пробирку 5-6 капель раствора a-нафтола, а в другую пробирку – 5-6 капель раствора тимола.

2. Осторожно подслаивают в обе пробирки по 1-2 мл концентрированной серной кислоты. Наблюдают фиолетовое (в случае a-нафтола) и красное (в случае тимола) окрашивание на границе раздела серной кислоты и раствора сахара.

3. Проделывают те же реакции, взяв вместо раствора сахара раствор белка.

Отмечают положительную реакцию, указывающую на наличие углеводных групп в белке.

 

РАБОТА №3

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЗОТА ПО МЕТОДУ КЬЕЛЬДАЛЯ

Определение основано на превращении азота, имеющегося в органическом веществе, в форму аммиака. Органические вещества с крепкой серной кислотой при сильном нагревании окисляются до углекислоты и воды, азот превращается в аммиак, связанный в виде сульфата аммония.

Реакция идет по следующему уравнению, в котором в качестве примера, взята аминокислота аланин:

 

2CH₃CHNH₂COOH + 13H₂SO₄ ® (NH₄)₂SO₄ + 6CO₂ + 12SO₂ + 16H₂O

 

Сжигание необходимо проводить под тягой, так как выделяется сернистый газ. В качестве катализатора при сжигании применяется кристаллическая сернокислая медь и другие вещества.

Дальнейшие операции имеют целью количественное определение образовавшегося аммиака. Для этого содержимое колбы переносят в аппарат для отгонки аммиака и прибавляют концентрированный раствор щелочи для нейтрализации серной кислоты, а также для того, чтобы реакция среды была сильно щелочной. Нагревание раствора в аппарате и отгонка аммиака производится при помощи пара. При этом сернокислый аммоний разлагается с выделением свободного аммиака:

 

(NH₄)₂SO₄ + 2NaOH ® 2NH₃↑ + NaSO₄ + 2H₂O

 

Конец форштоса холодильника обязательно должен быть погружен в определенный объем титрованного раствора серной кислоты, таким образом, чтобы отогнанный аммиак поступал в приемную колбу с титрованным раствором серной кислоты. Конец отгонки определяется по реакции на лакмус отгоняемого дистиллята.

Остаток серной кислоты (не связанный аммиаком в приемной колбе) титруют раствором щелочи до нейтральной реакции и по разности узнают количество серной кислоты связанной аммиаком (1 мл 0,1 н серной кислоты соответствует 1,4 мг азота). Общий азот выражают в % к весу сухого вещества. Расчет белка по азоту производится путем умножения количества миллиграмм азота на коэффициент 6,25.

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВОГО И НЕБЕЛКОВОГО АЗОТА

(путем осаждения медью)

1 г испытуемого материала в колбе на 200-250 мл обливают 50 мл теплой воды (50°С), смешивают и подогревают в водяной бане при 40°-50°С в течение 10 минут. Затем прибавляют 25 мл 6% раствора сернокислой меди и после тщательного перемешивания медленно приливают 25 мл 1,25% едкого натра.

Примерно через час, когда отстоится осадок, жидкость сливают через фильтр, а осадок несколько раз промывают водой (50°С) с декантацией ее через фильтр, затем осадок переносят на фильтр и снова промывают до полного обесцвечивания фильтра. В полученном фильтрате содержится небелковый азот, а в промытом осадке – белковый азот.

Для определения белкового азота осадок вместе с фильтром переносят в колбу Къельдаля и сжигают с серной кислотой (15 мл). По окончании сжигания содержимое колбы Къельдаля количественно переносят в мерную колбу на 200 мл. доводят водой до метки, берут для определения 50 мл раствора и переносят в аппарат для отгонки аммиака.

Для определения небелкового азота фильтрат, путем добавления воды, доводят до объема 250 мл, из него берут 50 мл в колбу Къельдаля количественно переносят в аппарат для отгонки аммиака.

Содержание белкового и небелкового азота выражают в % к весу взятого для анализа материала.

 

Пример расчета

При определении белкового азота на оттитрование избытка 0,1 н серной кислоты, взятой в объем 15 мл, пошло 8 мл н NaOH.

Следовательно, с кислотой связалось 15–8 = 7 мл, что соответствует 7´1,4 = 9,8 мг азота.

С учетом разбавления для определения было взято

1 × 50 = 0,25

следовательно, 0,25 г испытуемого вещества содержит 9,8 мг или 0,0098 г азота;

или 0,0098 × 100 = 3,9% азота

0,25

 

или 0,0098 × 100 × 6,25 = 24,37% белка

0,25

При определении небелкового азота на оттитрование избытка кислоты, взятой в объеме 10 мл, пошло 8 мл щелочи, что соответствует (10-8)´1,4=2,8 мг азота.

С учетом разбавления для определения было взято:

1 × 50 = 0,2 г вещества

Следовательно, 0,2 г испытуемого вещества содержит 2,8 мг или 0,0028 г азота, или

0,0028 × 100 = 1,4% азота.

0,2

 

II. ОБМЕН БЕЛКОВ

 

Белки являются необходимой составной частью пищи человека и животных. Значительные количества белков содержатся в ряде пищевых продуктов животного происхождения (мясо, яйца, творог, сыр и т.п.) и в некоторых продуктах растительного происхождения (горох, фасоль, бобы и т.п). Злаки содержат меньше белка: однако, так как хлеб обычно занимает большое место в питании, он является одним из важнейших источников пищевого белка.

В желудке белки перевариваются пепсином до высокомолекулярных продуктов распада – пептонов. В двенадцатиперстной кишке происходит более глубокое переваривание белков и пептонов под действием ферментов поджелудочного сока. Переваривание до аминокислот и простейших пептидов происходит в тонком кишечнике под влиянием пептидаз кишечного сока (эрепсина).

Всосавшись из кишечника, аминокислоты и простейшие пептиды частично задерживаются печенью. Когда аминокислоты не поступают из кишечника, печень отдает их в кровь, поддерживая в крови довольно постоянный уровень содержания аминокислот. В клетках различных тканей, а также в эритроцитах концентрация аминокислот всегда выше, чем в окружающей их плазме.

Аминокислоты, доставленные кровью к тканям, идут на построение белков. Аминокислоты, оставшиеся неиспользованными для биосинтеза белка, а также образовавшиеся в результате протеолиза в тканях, подвергаются ряду превращений. При распаде аминокислот в тканях азот отщепляется в виде аммиака. Последний, частично соединяясь с кислотами, выделяется с мочой в виде солей аммония. Главная же часть аммиака превращается в мочевину, которая и является основным конечным продуктом белкового обмена у человека. Наряду с мочевиной азот выделяется также в виде креатинина, мочевой кислоты и других веществ. в мышцах и мочевом пузыре морских рыб часто встречается триметиламиноксид (СН3)3N = O, являющийся одним из продуктов азотистого обмена. У пресноводных рыб – его меньше.

 

РАБОТА №4

ПЕРЕВАРИВАНИЕ БЕЛКА ПЕПСИНОМ

Пепсин (главный фермент желудочного сока) принадлежит к протеиназам и в кислой среде (рН = 1,5 – 2) гидролитически расщепляет белки до пептонов.

Переваривание белков пепсином можно хорошо наблюдать на фибрине, который под действием пепсина становится растворимым, переходя в пептон.

1. В одну пробирку наливают 3-4 мл 0,2% соляной кислоты; во вторую пробирку – 3-4 мл желудочного сока или раствора пепсина в соляной кислоте; в третью пробирку – 3-4 мл желудочного сока или раствора пепсина в соляной кислоте, предварительно нейтрализованного на лакмус содой; в четвертую пробирку – 3-4 мл предварительно прокипяченного и охлажденного желудочного сока или прокипяченного и охлажденного раствора пепсина в соляной кислоте.

2. Помещают в каждую пробирку по небольшому кусочку фибрина примерно равной величины и все пробирки ставят одновременно в водяную баню при 37-40°С.

3. Через полчаса или час вынимают пробирки из бани и наблюдают результаты исследования. В первой пробирке должно произойти лишь набухание фибрина под действием кислоты; во второй – переваривание (растворение) фибрина; в третьей – фибрин остается без изменения, так как пепсин в нейтральной среде не активен; в четвертой – происходит набухание фибрина под действием соляной кислоты, но переваривание не имеет места, так как пепсин разрушен кипячением.

4. Отфильтровывают небольшую порцию из каждой пробирки и проделывают с каждым фильтратом биуретовую реакцию. Реакция получается только с фильтратом из второй пробирки, где произошло переваривание фибрина и через фильтр прошли растворимые пептоны.

 

РАБОТА №5

 

ПЕРЕВАРИВАНИЕ БЕЛКА ТРИПСИНОМ

Под действием трипсина происходит гидролитическое расщепление пептонов, а также белков.

Оптимум действия трипсина лежит при слабо щелочной реакции (рН = 8 – 8,7). Обычно белковые вещества расщепляются трипсином быстрее, чем пепсином, однако белки кровяной сыворотки и соединительной ткани скорее расщепляются пепсином. Переваривание белков трипсином модно наблюдать на фибрине или казеине, которые под действием трипсина претерпевают глубокое гидролитическое расщепление.

 

1. Переваривание фибрина

1. В одну пробирку наливают 3-4 мл раствора трипсина или панкреатина (щелочная среда); во вторую пробирку – 3-4 мл раствора трипсина или панкреатина, предварительно нейтрализованного соляной кислотой на лакмус; в третью пробирку – 3-4 мл подкисленного раствора трипсина или панкреатина.

2. Помещают в каждую пробирку по небольшому кусочку фибрина примерно равной величины и одновременно ставят все пробирки в водяную баню при 37-40°С.

3. Через полчаса или час вынимают пробирки из бани и наблюдают результаты исследования. В первой пробирке должно иметь место переваривания (растворение) фибрина; во второй пробирке может быть лишь очень небольшое переваривание, так как в нейтральной среде трипсин слабо активен; в третьей пробирке наблюдается только набухание фибрина.

4. Отфильтровывают часть жидкости из каждой пробирки и проделывают фильтратом биуретовую реакцию. Положительная реакция указывает на присутствие в фильтрате продуктов переваривания белка.

 

2. Переваривание казеина

1. В колбочку наливают 25-30 мл вытяжки трипсина или раствора панкреатита и помещают туда 3-5 г казеина.

2. Перемешивают содержимое, добавляют около 5 мл хлороформа (для предотвращения гниения), закрывают колбочку ватой и ставят в термостат при 37-40°С на 4-5 суток (до следующего занятия).

3. На следующем занятии нагревают колбочку до кипения и добавляют по каплям уксусную кислоту до слабокислой реакции. При этом осаждаются не переваренные белки.

4. Охлаждают смесь, погрузив колбочку в холодную воду, и фильтруют для освобождения от белков.

5. Отливают порцию фильтрата (3-4 мл) в пробирку и добавляют по каплям бромную воду.

Появление розово-фиолетового окрашивания, исчезающего от избытка реактива, указывает на присутствие свободного триптофана.

6. К другой порции фильтрата (около 2 мл) добавляют 8-10 капель концентрированной серной кислоты и 5-6 мл раствора сернокислой ртути в серной кислоте, перемешивают содержимое и оставляют стоять на 10-15 минут.

7. Образовавшийся желтый осадок ртутного соединения триптофана отфильтровывают, сохраняя фильтрат, и промывают на фильтре 4-5 маленькими порциями (по 1-2 мл) дистиллированной воды.

8. Небольшим количеством (около 0,5 мл) воды переносят осадок в пробирку. Делят осадок и фильтрат на три части и проделывают как с осадком, так и с фильтратом реакции Адамкевича, Миллона и ксантопротеиновую (см. Цветные реакции на белки).

Отмечают положительные реакции Адамкевича и ксантопротеиновую и отрицательную реакцию Миллона с осадком, что указывает на присутствие триптофана и отсутствие тирозина.

Положительная ксантопротеиновая и миллонова реакции и отрицательная реакция Адамкевича с фильтром указывают на наличие в фильтрате тирозина и отсутствие триптофана.

Окрашивание при проведении ксантопротеиновой реакции (в особенности с осадком) появляется медленно (обычно через 15-20 минут).

3. Выделение триметиламинооксида СН₃

СН₃—N=О

 

СН₃

 

Морскую рыбу (напр. треску, сайру и т.п.) без головы, хвоста и плавников измельчают и обрабатывают последовательно 3 раза двойным объемом воды при нагревании. Затем соединенные экстракты фильтруют, упаривают до небольшого объема и прибавляют насыщенного спиртового раствора пикриновой кислоты. Выпадает желтый осадок пикрата триметиламинооксида: C₃H₉Na · C₆H₂(Na₂)₃OH. Если его отфильтровать и обработать HCl – выпадает белый осадок C₃H₉NaHCl.

 

 

III. ФЕРМЕНТЫ

Почти все химические процессы в организмах и в различных производственных смесях протекают при участии ферментов. Ферменты являются биологическими катализаторами белковой природы.

Ферменты очень чувствительны к воздействию тепла, кислот, щелочей и солей металлов.

Большинство ферментов в водном растворе при комнатной температуре быстро теряет свою активность, поэтому растворы и препараты ферментов необходимо хранить при пониженных температурах. При длительной работе с растворами ферментов необходимо вносить антисептики (толуол или тимол) во избежание развития в растворах микроорганизмов.

Ферменты можно экстрагировать из растительного или животного материала водой, а затем водным экстрактом действовать на тот или иной субстрат (например, на крахмал или на белок). Учитывая количество образующих продуктов реакции или изменения субстрата определяют активность того или иного фермента. Так определяется активность ферментов, растворимых в воде. Однако ферменты не всегда растворяются в воде. Например, фермент липаза из семян клещевины не растворяется в воде. Поэтому в некоторых случаях применяются автолитические методы, основанные на том, что размолотый и растертый испытуемый материал помещается в воду и оставляется на определенное время при температуре 40-45°С. Под действием как растворимых, так и нерастворимых ферментов, содержащихся в испытуемом материале, происходят соответствующие реакции. Таким образом, определяется суммарное действие ферментов, как растворимых в воде, так и нерастворимых.

Действие ферментов можно определить по вызываемому ферментами изменению окраски субстрата, по накоплению продуктов распада субстрата, по изменению вязкости, по изменению угла вращения плоскости поляризации и другими способами.

 

ПРОТЕОЛИЗ

Расщепление белковых веществ катализируется протеолитическими ферментами. Протеолитические ферменты (или протеазы) в зависимости от характера их действия делятся на 2 группы: протеиназы и полипептидазы.

Протеиназы гидролизуют белки до аминокислот и пептидов, полипептидазы действуют на пептиды, расщепляя их до аминокислот.

В растениях содержатся протеолитических ферменты, называемые протеиназами типа папаина. Папаина обладает смешанными функциями протеиназы и полипептидазы, а потому расщепление белка под действием папаина идет с образованием паптидов и аминокислот.

Расщепление белка под действием протеолитических ферментов, называется протеолизом.

Степень протеолиза определяется либо путем химического анализа по накоплению водорастворимого азота, аминного азота или свободных аминокислот, либо физическими методами: по скорости разжижения желатина, по изменению консистенции клейковины и другими путями.

 

РАБОТА №6

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПРОТЕИНАЗ

(по учету водо-растворимого азота, после 1-2-х или 3-х часов протеолиза)

5 г испытуемого материала и 30 мл воды, нагретой до 40°С переносят в колбу, смешивают и ставят в термостат на 1-2 часа или 3 часа для протеолиза.

По истечении указанного времени добавляют смесь Барштейна (10 мл 6% раствора сернокислой меди и 10 мл 1,25% раствора едкого натрия) для прекращения ферментативного процесса и осаждения белков, тщательно перемешивают и ставят на 30 мин. в водяную баню при 45-50°С. После этого охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через складчатый фильтр. Первые порции мутного раствора (фильтрата) сливают обратно на фильтр. Для определения растворимых форм азота, не осаждаемых смесью Барштейна, берут 10 мл прозрачного фильтрата в колбу Къельдаля и определяют азот по методу Къельдаля. Активность протеиназ выражают в мг небелкового азота на 10 г испытуемого материала.

Одновременно проводят контрольное определение водорастворимого азота – поступают также как при определении активности протеиназ, но без настаивания, т.е. сразу испытуемый материал смешивают с водой и реактивом Берштейна, чтобы предупредить действие ферментов.

Степень протеолиза можно определить по нарастанию карбоксильных групп (метод Серенсена) или по учету прироста аминных групп (метод Ван - Слайка).

 

АМИЛОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ

В растениях запасной углевод – крахмал под действием ферментов амилаз может превращаться в декстрины и дисахарид мальтозу.

Амилазы (иначе называются диастаз) широко распространены в природе, они встречаются во всех растительных и животных организмах.

Амилазы встречаются в виде 2-х ферментов: осахаривающего и декстрирующего. Осахаривающий фермент был назван сахарогенамилазой или b-амилазой.

b-амилаза содержится в растениях (в клубнях картофеля, в покоящихся семенах хлебных злаков, в семенах сои). При действии на крахмал b-амилазы образуется около 54% мальтозы и декстрины.

Декстрирующий фермент a-амилаза находится во всех животных организмах, особенно в больших количествах образуется в поджелудочной железе и в слюнных железах, a-амилаза содержится также в низших растениях (плесневые грибы), в семенах сорго и в проросших семенах (солоде) ржи, пшеницы, проса и ячменя. В солоде содержится как a-, так и b-амилаза.

Образующиеся под действием амилазы продукты расщепления крахмала с йодом быстро теряют синюю окраску. Вначале они дают с йодом фиолетовую окраску, затем она переходит вследствие образования промежуточных продуктов расщепления крахмала амилазой – декстринов меньшего молекулярного веса, по-разному окрашивающихся от йода. В зависимости от окраски с йодом различают следующие промежуточные продукты расщепления крахмала:

Амилодекстрины – (средний молекулярный вес около 10.000), окрашиваются йодом в сине-фиолетовый цвет, осаждаются спиртом, вращают плоскость поляризации.

[a]²⁰_Д =+196°, восстанавливают реактив Фелинга на 1% по отношению к мальтозе. По своему строению они близки к крахмалу.

Эритродекстрины – (средний молекулярный вес 6.000-4.000) окрашиваются йодом в краснобурый цвет, осаждаются спиртом, вращают плоскость поляризации.

[a]²⁰_Д =+194°, воостанавливают раствор Фелинга на 2-3%.

Ахроодекстрины – (средний молекулярный вес 3700). Почти не окрашиваются йодом, растворяются в 70% спирте, вращают плоскость поляризации.

[a]²⁰_Д =+192°, обладают 10% восстанавливающей способностью по отношению к мальтозе.

Мальтодекстрины – (средний молекулярный вес около 1000). Не окрашиваются йодом, не осаждаются спиртом, вращают плоскость поляризации на [a]²⁰_Д =+183°, обладают восстанавливающей способностью на 30-40% по отношению к мальтозе.

Ферменты a- и b-амилазы проявляют свою активность в несколько разных условий температуры и реакции среды. На этом основано разделение ферментов и определение их активности. b-амилаза разрушается при нагревании до 70%С, тогда как a-амилаза при этой температуре сохраняет свою активность.

Влияние активной кислотности на действие амилолитических ферментов показывает, что один из них - a-амилаза проявляет наибольшую активность в слабокислой среде, при рН 6,3-5,6.

При более кислой реакции – при 4,8-3,3 этот фермент теряет свою активность. Фермент b-амилаза в кислой среде не инактивируется. Он имеет оптимум действия при рН 4,8.

Таким образом декстринирующие и осахаривающие ферменты действуют при разной реакции среды.

Амилолитические ферменты являются однокомпонентными ферментами. Расщепление крахмала у растений и животных может протекать также под действием фермента фосфорилазы, которая расщепляет каждую связь 1-4 в амилозе и в амилопектине; но по месту разрыва присоединяется не вода, а остаток фосфорной кислоты, причем образуется глюкозо – I-фосфат. Поэтому этот процесс называется не гидролиз, а фосфоролиз.

 

РАБОТА №7

 

ОПРЕДЕЛЯЕТСЯ АМИЛАЗНОЙ АКТИВНОЙСТИ СЛЮНЫ

Амилазную активность слюны выражают в количестве субстрата (крахмала), расщепляемого 1 мл слюны за определенный промежуток времени (например, 30 минут). Определение основано на нахождении максимального разведения, при котором исследуемая жидкость еще расщепляет крахмал до стадии красного окрашивания с йодом.

При определении амилазной активности слюны можно также наблюдать влияние на ферменты активаторов и парализаторов (ингибиторов). Так, хлористый натрий в разведенных растворах ускоряет действие амилазы слюны на крахмал. Растворы сернойкислой меди, наоборот, сильно замедляют действие амилазы слюны.

1. Наливают из бюретки в 10 пронумерованных пробирок по 1 мл дистиллированной воды.

2. В первую пробирку отмеривают 1 мл слюны, разведенной водой в 10 раз.

3. Перемешивают содержимое первой пробирки путем троекратного втягивания пипеткой жидкости из пробирки и последующего выпускания из пипетки. 1 мл полученного раствора переносят из первой пробирки во вторую.

4. Перемешивают таким же образом содержимое второй пробирки и переносят 1 мл из второй пробирки в третью и т.д. Этим способом получают ряд разведений. Концентрация фермента в каждой последующей пробирке в 2 раза меньше, чем в предыдущей. Из десятой пробирки 1 мл жидкости как излишний выливают.

5. Наливают во все 10 пробирки еще по 1 мл дистиллированной воды.

6. Наливают далее из бюретки во все 10 пробирок (начиная с десятой, потом в девятую и т.д.) по 2 мл раствора крахмала и перемешивают содержимое каждой пробирки. Добавление крахмала нужно производить с пробирки, содержащей наименьшую концентрацию амилазы, так как в ней расщепление на холоду идет очень медленно и ошибка за счет неодновременного прибавления субстрата практически не отразится на результатах определения.

7. Одновременно помешивают все 10 пробирок в нагретую до 37°С водяную баню.

8. Через 30 минут вынимают пробирки из бани, быстро охлаждают их током холодной воды, перемешивают содержимое каждой пробирки и ставят по порядку в штатив.

9. Прибавляют в каждую пробирку по 2 капли раствора йода, перемешивают и наблюдают в пробирках гамму цветов от желтого к синему. Желтый цвет свидетельствует об отсутствии крахмала, красно-бурый – о присутствии промежуточных продуктов расщепления – различных декстринов, синий – о присутствии крахмала или продуктов его начального расщепления.

10. Вычисляют амилазную активность исследуемой слюны. При этом исходят из следующего. В пробирке, где жидкость окрашена еще в синий цвет, должного расщепления крахмала не произошло. Достаточное расщепление крахмала, очевидно, имеет место в той пробирке, где нет синего оттенка. Пусть, например, это будет пятая пробирка (в шестой пробирке уже имеется синий оттенок). В пятой пробирке, не разведенной слюны было 1/320 мл, т.е. мы можем написать:

1 мл слюны расщепляет 2 мл 0,1% раствора крахмала

1 -װ- -װ- Х 0,1% - װ - -װ-

2,1

т.е. Х = 1 = 640

Следовательно, 1 мл неразбавленной слюны расщепляет за 30 минут при 37°С 640 мл 0,1% раствора крахмала. Это принято изображать следующим образом:

a(диастаза) 37° = 640 единицам (для данного случая).

31°

Для выяснения активирующего влияния хлористого натрия и парализующего влияния сернокислой меди при гидролизе крахмала амилазой поступают следующим образом.

Производят с одной и той же разведенной слюной три серии определений: 1) по изложенному выше, 2) беря вместо 1 мл дистиллированной воды (п. 5) по 1 мл раствора хлористого натрия и 3) беря вместо 1 мл дистиллированной воды (п. 5) по 1 мл раствора сернокислой меди.

При сравнении результатов всех трех определений обнаруживается разница в активности амилазы.

ОКИСЛИТЕЛЬНО – ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ.

В живом организме окислительно-восстановительные процессы протекают с большой скоростью при участии ряда ферментов. Окисление органическим веществ, образующихся в результате гидролитического распада белков, жиров, углеводов представляет собой химический процесс.

Окислительные процессы в организме могут протекать разными путями: путем присоединения кислорода, путем отдачи водорода, путем отнятия электронов. Все окислительные ферменты делятся на 2 большие группы: оксидазы и дегидрогеназы.

Оксидазы катализируют реакции окисления органических веществ кислородом воздуха. По химической природе оксидазы являются металлопротеидами. В состав простетической группы входит медь или железо. При окислении или восстановлении металлы простетических групп меняют свою валентность, отдавая электроны молекулярному кислороду и принимая их снова от окисляемого вещества. К группе оксидаз относятся полифенол – оксидаза, аскорбиноксидаза, тирозиназа и цитохромоксидаза.

Дегидрогеназы катализирует перенос водорода с окисляемого вещества на соответствующий акцептор. Акцептором водорода может быть кислород или какое-либо вещество, содержащееся в тканях. Дегидрогеназы подразделяют на: анаэробные и аэробные дегидрогеназы.

Анаэробные дегидрогеназы. Коферментом этих дегидрогеназ является никотинамидадениндинуклеотид (НАД).

Коферментом других анаэробных дегидрогеназ является никотинамидадениндинуклеотид фосфат (НАДФ).

Дегидрогеназы, содержащие в качестве активной группы НАД и НАДФ окисляют самые разнообразные вещества: молочную, яблочную, изолимонную, глутаминовую кислоты, различные альдегиды и спирты. Они отнимают водород от ряда органических соединений. В результате происходит окисление данного соединения, при этом фермент превращается в восстановленную форму, в дальнейшем передает водород флавиновому ферменту, либо какому-нибудь другому промежуточному соединению.

Аэробные дегидрогеназы. Передают водород, отнятый от окисляемого вещества или от восстановленной формы анаэробной дегидрогеназы, кислороду воздуха или метиленовой сини.

Активной группой аэробных дегидрогеназ является рибофлавин (витамин В₂). Флавиновые дегидрогеназы окрашены в желтый цвет, а восстановленная форма этих ферментов – лейкофлавины, как и восстановленная форма метиленовой сини, является бесцветным соединением.

Восстановленные формы флавиновых ферментов могут передавать свой водород не только кислороду воздуха или метиленовой сини, но и полифенолксидазной или цитохромоксидазной системе.

Пероксидазами называются ферменты, которые катализируют окисление некоторых фенолов, полифенолов, аминов перекисью водорода или органическими перекисями. Органические перекиси возникают при окислении кислородом воздуха легко окисляющихся веществ (каротиноидов, терпенов, насыщенных жирных кислот).

Катализа обладает способностью разлагать перекись водорода на молекулярный кислород и воду. Этот фермент очень чувствителен к нагреванию. Определение активности катализы используют при определении семенных качеств зерна, режимов сушки и длительности хранения зерна.

 

 

РАБОТА №8

 

КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА КАТАЛАЗУ

Каталаза – фермент, разлагающий перекись водорода по уравнению:

2H₂O₂ → 2H₂O + O₂

Каталаза широко распространена и содержится в большем или меньшем количестве во всех тканях и жидкостях организма. Биологическая роль каталазы заключается в разрушении вредной для организма перекиси водорода, которая накапливается в тканях при окислительных процессах.

1. В пробирку помешивают 0,3-0,5 расчетной печени, добавляют около 10 мл воды и перемешивают содержимое.

2. Быстро наливают раствор перекиси водорода до верха пробирки и сейчас же, закрыв пробирку пальцем, опрокидывают ее в стакан с водой, не выливая жидкости. Наблюдают выделение газа (кислорода) в пробирке и вытеснение им жидкости в стакан.

3. Закрыв пробирку пальцем, осторожно вынимают ее из воды, переворачивают и быстро вносят в пробирку тлеющую лучинку или тлеющую пробку на проволочке. Разгорание лучинки (или пробки) указывает на то, что выделившийся газ является кислородом.

 

РАБОТА №9

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ (ПО БАХУ И ОПАРИНУ)

5 г испытуемого материала настаивают в течение 2 часов со 100 мл воды и несколькими каплями толуола при комнатной температуре. Жидкость фильтруют через сухой складчатый фильтр. Для опыта берут две порции по 20 мл прозрачного фильтрата. Одна порция (контрольная) быстро кипятится для инактивации фермента, другая порция является опытной. К опытной и к контрольной порции прибавляют по 20 мл воды и по 3 мл 1% перекиси водорода и оставляют на 30 минут при комнатной температуре. По истечении этого времени действие фермента останавливают путем добавления 3 мл 10% серной кислоты и оставщуюся перекись водорода титруют 0,1 н перманганата. Разность и количество израсходованного 0,1 н перманганата на титрование контрольной и опытной порции показывает активность каталазы. Реакция протекает следующим образом:

5H₂O₂ + 2KMnO₄ + 4H₂SO₄ → 5O₂ + 2KHSO₄ + 8H₂O + 2MnSO₄

Активность каталазы выражают на 1 г испытуемого материала в мл 0,1 н перманганата или в мл перекиси водорода 1 мл 0,1 н KMnO₄ соответствует 1,7 мг перекиси водорода.

 

РАБОТА №10

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ДЕГИДРОГЕНАЗ У ДРОЖЖЕЙ

5 г прессованных дрожжей растворяют в 100 мл 5% раствора сахарозы, до получения однородной взвеси. 20 мл взвеси помещают в коническую колбу и кипятят в течение 5 минут от начала кипения. После охлаждения прокипяченную взвесь вносят в пробирку, заполняя ее до половины объема. В другую, опытную пробирку вносят такой же объем непрокипяченой взвеси дрожжей и в обе пробирки прибавляют по 2 капли метиленовой сини. Затем обе пробирки этикетируют и ставят в водяную баню при температуре 45°С. Отмечают время и следят за изменением окраски. Когда в одной из пробирок метиленовая синь полностью обесцветится, отмечают время окончания опыта. Метиленовая синь должна обесцвечиваться в опытной пробирке с непрокипяченой взвесью дрожжей, в то время, как в контрольной пробирке, если время кипячения было полностью выдержано, окраска должна остаться ярко голубой. В опытной пробирке метиленовая синь обесцвечивается в результате восстановления водородом, переносимым дегидрогеназами дрожжей с окисляющегося фосфоглицеринового альдегида, на любые соединения, способные быть акцепторами водорода, одним из которых является метиленовая синь.

При встряхивании опытной пробирки ее бесцветное содержимое снова синеет.

 

РАБОТА №11

 

КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА ДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Дегидрогеназами называют ферменты, катализирующие окисление различных веществ путем отнятия от них водорода (дегидрогенирование), откуда и название этих ферментов.

Окисление веществ под действием дегидрогеназ происходит без участия кислорода (анаэробное окисление). Дегидрогеназой водород передается другим веществам, называемым акцепторами водорода, само же окисляемое вещество при этом отдает водород и является донатором водорода.

Действие дегидрогеназ можно наблюдать на примере дегидрогеназы молока и сукциндегидрогеназы мышц.

Дегидрогеназа молока способна окислять ряд субстратов. Согласно современным данным, ее следует рассматривать как ксантиндегидрогеназу, т.е. фермент, окисляющий ксантин в мочевую кислоту. Дегидрогеназа молока относительно устойчива к действию температуры, ее действие поэтому лучше наблюдать при температуре около 70°С.

Если в качестве субстрата окисления (донатора водорода) взять формальдегид, а в качестве акцептора водорода – метиленовую синь и оба эти вещества прибавить к молоку, то под действием дегидрогеназы молока происходит окисление муравьиного альдегида путем отнятия водорода, который присоединяется к метиленовой сини, восстанавливая этот краситель в бесцветное соединение (лейкооснование). В виде схемы происходящие при этом реакции можно изобразить следующим образом:

 

Н Н

Н—С +Н₂О → Н—С—ОН Гидратная форма

О ОН формальдегида

 

Н О

Н—С—ОН + Мс→Н—С + МсН₂

ОН ОН

Метиленовая Муравьиная Бесцветный продукт

синь кислот восстановления

метиленовой сини

 

Сукциндегидрогеназа дегидрирует яетарную кислоту, окисляя ее в фумаровую. Поэтому в присутствии сукциндегидрогеназы, янтарной кислоты и метиленовой сини происходит восстановлене (обесцвечивание) метиленовой сини.

 

СН₂СООН НООС • СН

+ Мс ―→ + МсН₂

СН₂СООН СН • СООН

Янтарная Метиленовая Фумаровая Продукт восстановления

кислота синь кислота метиленовой сини

(лейкосоединение)

 

1. 1.Наливают в 2 пробирки по 4-5 мл молока. Содержимое второй пробирки кипятят, а потом охлаждают. Добавляют в обе пробирки по 8-10 капель раствора формальдегиде и по 1-2 капли раствора метиленовой сини, взбалтывают и ставят в водяную баню при 70°С. Через некоторое время наблюдают обесцвечивание метиленовой сини в паервой пробирке и отсутствие обесцвечивания во второй пробирке.

2. После обесцвечивания первую пробирку сильно взбалтывают. Синее окрашивание появляется вновь вследствие окисления лейкооснования метиленовой сини за счет передачи его водорода кислороду воздуха:

 

МсН₂ + О₂ ® Мс + Н₂О₂

Лейкооснование Метиленовая

метиленовой сини синь (окисленная форма)

(восстановленная форма)

Если пробирку снова поставить в водяную баню, то метиленовая синь вновь обесцветится. Эту операцию можно повторять много раз. Метиленовая синь является при этом переносчиком водорода, и небольшое количество ее может окислить много формальдегида.

2. 1. Помещают в две пробирки по 3-4 мл мышечной кашицы. В первую пробирку добавляют около 0,5 мл нейтрализованного раствора янтарной кислоты.

2. В обе пробирки добавляют по 2 капли раствора метиленовой сини, встряхивают и ставят в баню при 37°С. Через некоторое время наблюдают обесцвечивание метиленовой сини в первой пробирке и отсутствие обесцвечивания во второй пробирке.

 

ГЛУТАТИОН

Глутатион широко распространенный в природе, серосодержащий трипептид, построен из остатков трех аминокислот: гликокола, глютаминовой кислоты и цистеина. Функциональной группой молекулы глутатиона является сульфгидриальная группа – SH, поэтому для восстановленного глутатиона принято сокращенное (Г-SH) обозначение:

 

СООН СООН

½ ½

СНNH₂ CHNH₂

½ ½

CH₂ CH₂

½ ½

CH₂ CH₂¾SH HS¾CH₂ CH₂

½ ½ ½ ½

CO¾NH¾CH CH¾NH¾CO

½ ½

HOOC¾CH₂¾NH¾CO CO¾NH¾CH2¾COOH

 

Восставленный глутатион может окисляться в дисульфидную форму мягкими окислителями:

 

¾2Н

Г ¾ SH + HS ¾ Г ¾¾® Г ¾ S ¾ S ¾ Г

(например, йодом, бромом)

 

Глутатион окисляется молекулярным кислородом в соответствующих условиях в присутствии катализаторов, а также дегидроаскорбиновой кислотой в присутствии соответствующего фермента.

Для превращения окисленой формы глутатиона в восстановленную необходимо действие сильных восстановителей или фермента глутатионредуктазы. Благодаря своей способности подвергаться ферментативному окислению и восстановлению глутатиона служит биологическим переносчиком водорода.

Протеиназы растений типа папина, как и целый ряд других протеолитических ферментов растительного происхождения активируются синильной кислотой и сульфгидрильными соединениями, содержащими – SH групп, например, аминокислота, цистеин.

Определение глутатиона основано на принципе окисления – SH групп йонноватокислым калием, но при этом могут окисляться и другие соединения.

 

РАБОТА №12

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛУТАТИОНА

Навеска дрожжей в 2 г растирается с кв