Определение фенотиазинов с помощью гемсодержащих биокатализаторов в водной и водно-органической средах

Борзенкова Н.В.

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,

Москва, Россия.

Аспирант 3г.

[email protected]

Научный руководитель: Шеховцова Т.Н.

Фенотиазины широко используют в медицине в качестве нейролептических, антидепрессивных, антиаритмических и др. средств. Для них характерно проявление побочных эффектов и длительное выведение из организма, а их передозировка может приводить к отравлениям и даже летальному исходу. В связи с этим необходим строгий контроль содержания фенотиазинов в крови и моче больных, а при патологоанатомических исследованиях также и во внутренних органах (желудочно-кишечном тракте, легких, почках). Для экстракции фенотиазинов из биологических объектов, а также растворения лекарственных средств при подготовке к анализу часто применяют органические растворители, в частности диметилсульфоксид (ДМСО). Вследствие этого актуальна разработка методик определения фенотиазинов в присутствии этого растворителя. Для решения указанных задач перспективно применение биологических катализаторов.

Целью настоящего исследования явилось сравнение каталитической эффективности гемсодержащих биокатализаторов – фермента пероксидазы хрена (нативного и включенного в комплекс с полисахаридом хитозаном) и белка гемоглобина в реакциях окисления промазина и хлорпромазина и разработка методик их определения.

Оптимизированы условия проведения окисления фенотиазинов пероксидом водорода в присутствии каждого из биокатализаторов. Установлено, что оптимальная концентрация гемоглобина в 55 раз превышает концентрацию пероксидазы в реакции окисления промазина и в 25 раз выше в реакции окисления хлорпромазина, что обусловлено разной природой этих катализаторов. На примере промазина показано, что пероксидаза более эффективный, чем гемоглобин, катализатор окисления фенотиазинов в водной среде (k_cat/K_m 2,0·10⁴ и 2,6·10² с^-1·мкМ^-1 соответственно). Разработаны методики определения промазина и хлорпромазина в диапазонах концентраций (10 – 100) мкМ и (10 – 200) мкМ с использованием гемоглобина и пероксидазы соответственно.

Основное ограничение использования ферментативных методов при определении малорастворимых в воде соединений в сложных матрицах заключается в недостаточной стабильности и активности биокатализаторов в органических и водно-органических средах. На примере промазина нами изучено влияние природы полярного органического растворителя на скорость биокаталитического окисления фенотиазинов. Найдено, что как в присутствии пероксидазы, так и гемоглобина скорость окисления промазина убывает в ряду растворителей: ДМСО > ацетонитрил > 1-пропанол. Максимально возможное содержание ДМСО в реакционной смеси составляет 20 и 30 об.% в присутствии пероксидазы и гемоглобина соответственно. Примечательно, что при этих содержаниях ДМСО скорость реакции в присутствии гемоглобина (k_cat 36 с^-1) в 2,5 раза выше, чем в присутствии фермента.

Стабильность пероксидазы в водно-органической смеси можно повысить включением ее в полиэлектролитный комплекс с хитозаном. Установлено, что в присутствии промазина возрастает скорость окисления о- дианизидина, катализируемого ферментом нативным и включенным в комплекс с хитозаном; при этом нативный фермент сохраняет активность при высоких содержаниях ДМСО (вплоть до 50 об.%). Описанный эффект является следствием “субстрат-субстратной” активации − ускорения окисления о -дианизидина среднеокисляемым субстратом-восстановителем пероксидазы - фенотиазином. Включение в комплекс с хитозаном повышает эффективность пероксидазы в реакции окисления о -дианизидина: значения k_cat/K_m в водной среде для нативного фермента и включенного в полиэлектролитный комплекс составили 1,5·10² и 2,8·10² с^-1·мкМ^-1 соответственно. В присутствии 30 об.% ДМСО в составе комплекса эффективность пероксидазы возрастает в 2,8 раза (k_cat/K_m 3,2·10² с^-1·мкМ^-1). Таким образом, в водной среде предпочтительно использование нативной пероксидазы, в средах с умеренным содержанием ДМСО более перспективно применение гемоглобина, а в средах с высоким содержанием этого органического растворителя – комплекса пероксидаза-хитозан.

Разработаны методики определения промазина и хлорпромазина в присутствии 30 об.% ДМСО по их активирующему действию в реакции окисления о -дианизидина в присутствии нативного фермента в диапазоне концентраций (0,1 – 0,8) мМ и (0,5 – 2) мМ соответственно. Применение полиэлектролитного комплекса пероксидаза−хитозан позволило повысить чувствительность определения фенотиазинов: диапазоны определяемых концентраций промазина и хлорпромазина составили (20 – 100) мкМ и (50 – 400) мкМ соответственно.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты №09-03-00823-а, 12-03-00249-а) и Министерства образования и науки РФ (госконтракт №П991).