Количественное определение аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в сыворотке крови

 

Аспартатаминотрансфераза (АсАТ, КФ: 2.6.1.1) и аланинаминотрансфераза (АлАТ, КФ: 2.6.1.2) – пиридоксальфосфатсодержащие ферменты.

АсАТ катализирует обратимый перенос аминогруппы от аспартата на a-кетоглутарат с образованием глутамата и оксалоацетата.

АлАТ катализирует обратимую реакцию переноса аминогруппы от аланина на a-кетоглутарат с образованием глутамата и пирувата (ПВК).

АлАТ содержится в цитозоле, тогда как для АсАТ известны 2 формы: цитоплазматическая и митохондриальная.

При поражении тканей аминотрансферазы «вымываются» из поврежденных клеток в кровоток, поэтому определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови имеет важное значение, особенно для диагностики поражений сердца и дифференциальной диагностики болезней печени. Так, при неосложненном инфаркте миокарда, уровень АсАТ в сыворотке крови начинает повышаться уже через 4-6 часов после наступления инфаркта, максимум активности приходится на вторые сутки и лишь на 5-8 день активность фермента снижается до нормы. Изменение активности сывороточной АлАТ при этом незначительно.

При инфекционном гепатите (болезни Боткина) и обострении хронического гепатита активности обеих аминотрансфераз в сыворотке крови повышаются (активность АлАТ повышается сильнее). Цирроз печени не сопровождается значительной гиперферментемией.

 

Цель работы

Определить активности обеих аминотрансфераз в сыворотке крови колориметрическим методом и сравнить полученные результаты с нормой.

 

Принцип метода

Определение активности обеих аминотрансфераз основано на колориметрическом обнаружении пирувата, образующегося за 1 час инкубации, по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином в щелочной среде. В случае АлАТ пируват образуется непосредственно из аланина, а в случае АсАТ пируват образуется из оксалоацетата после декарбоксилирования последнего в щелочной среде:

Аспартат + a-Кетоглутарат Глутамат + Оксалоацетат

Пируват CO₂

 

Активности обоих ферментов определяют по калибровочному графику.

 

Выполнение работы [‡‡] (см. приложение)

 

Реагенты, этапы	Опыт	Контроль
Субстрат для АсАТ или АлАТ, мл	0,25	0,25
Физиологический раствор, мл	—	0,05
Сыворотка крови, мл	0,05	—
Инкубируют 60 минут при 37 °С
2,4-Динитрофенилгидразин, мл	0,25	0,25
Перемешивают и оставляют на 20 минут при 20 °С
Раствор NaOH, мл	2,5	2,5
Через 10 мин фотометрируют против Н2О (l = 500 нм, толщина кюветы 0,5 см) D540
Dоп – Dк

 

Расчет активности производят в мккат/л по калибровочному графику:

 

Активность АлАТ или АсАТ в мккат/л	Dоп – Dк
0,1	0,025
0,2	0,05
0,3	0,08
0,4	0,11

 

Норма: АлАТ = 0,05 – 0,12 мккат/л; АсАТ = 0,06 – 0,14 мккат/л. Верхний предел – 0,42 мккат/л.

 

Выводы

Тестовые задания по теме: «Обмен аминокислот»

 

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

 

1. Тирозин является незаменимой аминокислотой для человека.

2. В окислительном дезаминировании аминокислот могут участвовать разные коферменты.

3. Реакции трансаминирования аминокислот необратимы.

4. В процессах трансдезаминирования и трансреаминирования аминокислот участвует α-кетоглутаровая кислота.

5. Коферентом аминотрансфераз служит ФАД.

6. В процессе трансаминирования выделяется аммиак.

7. Возможно ли превращение пировиноградной кислоты в аланин в организме человека?

8. Является ли фенилаланин предшественником серотонина?

9. Используют ли определение активности аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови человека для диагностики инфаркта миокарда?

10. Нужен ли витамин В₁ для реакций трансаминирования?

11. Усиливается ли глюконеогенез при сахарном диабете?

12. Участвуют ли лизин и треонин в реакциях трансаминирования?

 

2) Выбрать один правильный ответ

 

Метаболит ЦТК, участвующий в реакциях трансаминирования: 1. цитрат 2. изоцитрат 3. сукцинат 4. фумарат 5. оксалоацетат

Гликогенной аминокислотой не является: 1. аргинин 2. глутамин 3. гистидин 4. лейцин 5. метионин

3) Установить соответствие названия вещества и его предшественника

1. гистамин 2. γ-аминомасляная кислота 3. серотонин 4. таурин 5. дофамин

А. тирозин Б. триптофан В. цистеин Г. гистидин Д. глутамат