Первый синтез пептидного гормона – окситоцина

Содержание

1. Введение…………………………………………………………………………3

2. Что такое пептиды?..........................................................................................4

2.1. Строение пептидов……………………………………………………….5

2.2. Синтез пептидов………………………………………………………….7

3. Твердофазный синтез пептидов……………………………………………10

3.1. Метод Мерринфилда……………………………………………………10

3.2. Твердая подложка……………………………………………………….14

3.3. Выбор подложки………………………………………………………...14

3.4. Линкеры………………………………………………………………….16

4. Первый синтез природного гормона – окситоцина……………………….22

5. Синтез инсулина в клетке…………………………………………………..30

6. Заключение…………………………………………………………………..34

7. Литература…………………………………………………………………...35

 

Введение

В органической химии нет ни одной реакции, обеспечивающей на практике количественные выходы целевых продуктов в любом случае. Единственное исключение составляет, по-видимому, полное сжигание органических веществ в кислороде при высокой температуре до СО₂ и Н₂О. Поэтому очистка целевого продукта является сложной и трудоемкой задачей. Например, 100%-ная очистка продуктов пептидного синтеза является трудноразрешимой проблемой. Действительно, первый полный синтез пептида, гормона окситоцина (1953 г), содержащего всего 8 аминокислотных остатков, рассматривался как выдающееся достижение, принесшее его автору, В. дю Виньо, Нобелевскую премию 1955 г. Однако уже в следующие двадцать лет синтезы полипептидов подобной сложности превратились в рутину, так что в настоящее время синтез полипептидов, состоящих из 100 и более аминокислотных остатков, уже не рассматривается как непреодолимо трудная задача.

Цель работы: разобрать и объяснить: «Что вызвало столь драматические изменения в области синтеза полипептидов?»

 

 

Что же такое пептиды?

Пептиды- природные или синтетические соединения, молекулы которых построены из остатков альфа-аминокислот, соединенных между собой пептидными (амидными) связями C(O) NH. Могут содержать в молекуле также неаминокислотную компоненту (напр., остаток углевода). По числу аминокислотных остатков, входящих в молекулы пептидов, различают дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и т.д. Пептиды, содержащие до 10 аминокислотных остатков, называются олигопептидами, содержащие более 10 аминокислотных остатков полипептидами Природные полипептиды с молекулярной массой более 6 тыс. называются белками.

Впервые пептиды были выделены из ферментативных гидролизатов белков. Термин "пептиды" предложен Э. Фишером. Первый синтетический пептид получил T. Курциус в 1881г. Э. Фишер к 1905 разработал первый общий метод синтеза пептидов и синтезировал ряд олигопептидов различного строения. Существующий вклад в развитие химии пептидов внесли ученики Э. Фишера Э. Абдергальден, Г. Лейке и M. Бергман. В 1932 г. M Бергман и Л. Зервас использовали в синтезе пептидов бензилоксикарбонильную группу (карбобензоксигруппу) для защиты альфа-аминогрупп аминокислот, что ознаменовало новый этап в развитии синтеза пептидов. Полученные N-защищенные аминокислоты (N-карбобензоксиаминокислоты) широко использовали для получения различных пептидов, которые успешно применяли для изучения ряда ключевых проблем химии и биохимии этих веществ, например, для исследования субстратной специфичности протеолитических ферментов. С применением N-карбобензоксиаминокислот были впервые синтезированы природные пептиды(глутатион, карнозин и др.). Важное достижение в этой области разработанный в начале 50-х гг. P. Воганом и др. синтез пептидов методом смешанных ангидридов.

В 1953 В. Дю Виньо синтезировал первый пептидный гормон -окситоцин. На основе разработанной P. Меррифилдом в 1963 концепции твердофазного пептидного синтеза были созданы автоматические синтезаторы пептидов. Получили интенсивное развитие методы контролируемого ферментативного синтеза пептидов. Использование новых методов позволило осуществить синтез гормона инсулина и др.

Успехи синтетической химии пептидов были подготовлены достижениями в области разработки таких методов разделения, очистки и анализа пептидов, как ионообменная хроматография, электрофорез на различных носителях, гель-фильтрация, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), иммуно-химический анализ и др. Получили большое развитие также методы анализа концевых групп и методы ступенчатого расщепления пептидов. Были, в частности, созданы автоматические аминокислотные анализаторы и автоматические приборы для определения первичной структуры пептидов-так называемых секвенаторы.

Строение пептидов

Пептидная связь имеет свойства частично двойной связи. Это проявляется в уменьшении длины этой связи (0,132 нм) по сравнению с длиной простой связи C N (0,147 нм). Частично двоесвязный характер пептидной связи делает невозможным свободное вращение заместителей вокруг нее, поэтому пептидная группировка является плоской и имеет обычно транс-конфигурацию (ф-ла I). Tаким образом, остов пептидной цепи представляет собой ряд жестких плоскостей с подвижным ("шарнирным") сочленением в месте, где расположены асимметричные атомы С (в ф-ле I обозначены звездочкой).

В растворах пептидов наблюдается предпочтительное образование определенных конформеров. С удлинением цепи более выраженную устойчивость приобретают (аналогично белкам) упорядоченные элементы вторичной структуры. Образование вторичной структуры особенно характерно для регулярных пептидов, в частности для полиаминокислот.

Свойства

Олигопептиды по свойствам близки к аминокислотам, полипептиды подобны белкам. Олигопептиды представляют собой, как правило, кристаллические вещества, разлагающиеся при нагревании до 200 300 ⁰C. Они хорошо растворимы в воде, разбавленных кислотах и щелочах, почти не растворимы в органических растворителях. Исключения составляют олигопептиды, построенные из остатков гидрофобных аминокислот.

Олигопептиды обладают амфотерными свойствами и, в зависимости от кислотности среды, могут существовать в форме катионов, анионов или цвиттер-ионов. Основные полосы поглощения в ИК спектре для группы NH 3300 и 3080 см^-1, для группы C=O 1660 см^-1. В УФ спектре полоса поглощения пептидной группы находится в области 180-230 нм. Изоэлектрическая точка (рI) пептидов колеблется в широких пределах и зависит от состава аминокислотных остатков в молекуле. Величины рК_а пептидов составляют для а-СООН ок. 3, для -H₂ ок. 8.

Химические свойства олигопептидов определяются содержащимися в них функциональными группами, а также особенностями пептидной связи. Их химические превращения в значительной мере аналогичны соответствующим реакциям аминокислот. Они дают положительную биуретовую реакцию и нингидриновую реакцию. Дипептиды и их производные (особенно эфиры) легко циклизуются, превращаясь в дикетопиперазины. Под действием 5,7 нормальной соляной кислоты пептиды гидролизуются до аминокислот в течение 24ч при 105 ⁰C.

Синтез пептидов

В пептидном синтезе используются известные из органической химии реакции получения амидов и специально разработанные методы для синтеза пептидов. Для успешного осуществления этих синтезов необходимо активировать карбоксильную группу, т.е. увеличить электрофильность карбонильного углерода. Это достигается путем химической модификации карбоксильной группы аминокислот. Тип такой модификации обычно определяет название метода пептидного синтеза.

 

1. Хлорангидридный метод.

В основе метода лежит реакция получения амидов взаимодействием хлорангидридов кислот с соответствующими аминами. Именно этим способом были получены первые пептиды. В настоящее время этот метод применяется крайне редко, поскольку он сопровождается образованием побочных продуктов и рацемизацией пептидов.

2. Азидный метод

Исходным веществом в данном способе чаще всего является этиловый эфир N-защищенной аминокислоты, из которой получают гидразид, последний превращают с помощью нитрита натрия в присутствии соляной кислоты в азид кислоты. В реакции обычно применяют гидразин, у которого один из азотов заблокирован защитной группой (Z-карбобензокси- или карботретбутилоксигруппа), что позволяет избежать образования побочных дигидразидов. Азиды при взаимодействии с С-защищенными аминокислотами в мягких условиях образуют пептиды.

Рацемизация в этом методе сведена к минимуму, однако могут протекать побочные реакции, а именно: азиды могут перегруппировываться в изоцианаты, которые в свою очередь при взаимодействии со спиртом, используемым в качестве растворителя, образуют уретаны.

 

3. Смешанные ангидриды

Широкое применение в пептидном синтезе нашли смешанные ангидриды аминокислот с производными угольной кислоты, получаемые, например, с помощью изобутилхлоркарбоната:

Реакцию в этом синтезе проводят при низкой температуре (-10..-20 С), достаточно быстро, что значительно снижает возможность образования побочных продуктов и рацемизации. Быстрый ступенчатый синтез пептидов с использованием смешанных ангидридов носит название REMA-синтез. Методы образования с использованием смешанных ангидридов широко применяются в твердофазном синтезе пептидов.

Таким образом, проведение пептидного синтеза требует учета и жесткого соблюдения некоторых факторов. Так, с целью снижения образования побочных продуктов и рацемизации, рекомендуются следующие типовые условия проведения реакции образования пептидной связи:

1)процесс необходимо проводить при низких температурах, время реакции должно быть минимальным;

2)реакционная масса должна иметь рН, близкую к нейтральной;

3) в качестве кислотосвязывающих реагентов используют органические основания, как пиперидин, морфолин и т.д;

4) проведение реакции желательно в безводных средах.

Твердофазный синтез

Твердофазный синтез - методический подход к синтезу олигомеров (полимеров) с использованием твердого нерастворимого носителя, представляющего собой органический или неорганический полимер.

В начале 60-х годов был предложен новый подход к решению проблем выделения и очистки, возникающих в пептидном синтезе. Позже автор открытия этого подхода, Р.Б. Меррифилд, в своей Нобелевской лекции рассказал, как это произошло: “Однажды у меня возникла мысль о том, как может быть достигнута цель более эффективного синтеза пептидов. План состоял в том, чтобы собирать пептидную цепь постадийно, причем во время синтеза цепь должна быть одним концом привязана к твердому носителю”. В результате выделение и очистка промежуточных и целевых производных пептидов сводились просто к фильтрованию и тщательной промывке твердого полимера для удаления всех избыточных реагентов и побочных продуктов, остающихся в растворе. Такая механическая операция может быть выполнена количественно, легко стандартизируется и может быть даже автоматизирована. Рассмотрим эту процедуру более подробно.

Методе Меррифилда

Полимерный носитель в методе Меррифилда - это гранулированный сшитый полистирол, содержащий хлорметильные группы в бензольных ядрах. Эти группы превращают полимер в функциональный аналог бензилхлорида и сообщают ему способность легко образовывать сложноэфирные связи при реакции с карбоксилат-анионами. Конденсация такой смолы с N-защищенными аминокислотами ведет к образованию соответствующих бензиловых эфиров. Удаление N-защиты из дает С-защищенное производное первой аминокислоты, ковалентно связанное с полимером. Аминоацилирование освобожденной аминогруппы N-защищенным производным второй аминокислоты с последующим удалением N-защиты приводит к аналогичному производному дипептида также привязанному к полимеру:

Такой двустадийный цикл (удаление защиты-аминоацилирование) может быть, в принципе, повторен столько раз, сколько требуется для наращивания полипептидной цепи заданной длины.

Использование твердого носителя само по себе еще не может упростить решение проблемы отделения n-звенного пептида от его (n-1)-членного предшественника, поскольку оба они привязаны к полимеру. Однако этот подход позволяет безопасно использовать большие избытки любого реагента, необходимые для достижения практически 100%-ной конверсии (n-1)-членного предшественника в n-членный пептид, так как привязанные к носителю целевые продукты на каждой стадии могут быть легко и количественно освобождены от избыточных реагентов (что было бы весьма проблематично при работе в гомогенных системах).

Сразу же стало понятно, что возможность очистки продукта после каждой реакции путем простого фильтрования и промывки, и то, что все реакции можно проводить в одном реакционном сосуде, составляют идеальные предпосылки для механизации и автоматизации процесса. Действительно, всего три года потребовалось для разработки автоматической процедуры и аппаратуры, позволяющих выполнять программируемый синтез полипептидов с заданной последовательностью аминокислотных остатков. Первоначально и сама аппаратура (емкости, реакционные сосуды, шланги), и система управления были очень примитивны. Тем не менее, мощь и эффективность общей стратегии были убедительно продемонстрированы рядом пептидных синтезов, выполненных на этом оборудовании. Так, например, с помощью такой полуавтоматической процедуры был успешно выполнен синтез природного гормона инсулина, построенного из двух полипептидных цепей (состоящих из 30 и 21 аминокислотных остатков), связанных дисульфидным мостиком.

Твердофазная техника приводила к существенной экономии труда и времени, необходимых для пептидного синтеза. Так, например, ценой значительных усилий Хиршмен с 22 сотрудниками завершили выдающийся синтез фермента рибонуклеазы (124 аминокислотных остатка) с помощью традиционных жидкофазных методов. Почти одновременно тот же белок был получен путем автоматизированного твердофазного синтеза. Во втором случае синтез, включающий 369 химических реакций и 11 931 операцию, был выполнен двумя участниками (Гатте и Меррифилд) всего за несколько месяцев (в среднем до шести аминокислотных остатков в день присоединялись к растущей полипептидной цепи). Последующие усовершенствования позволили построить полностью автоматический синтезатор.

Метод Меррифильда и послужил основой для нового направления органического синтеза – комбинаторной химии.

Хотя иногда комбинаторные эксперименты проводятся в растворах, но в основном, они осуществляются с использованием твердофазной техники – реакции протекают с использованием твердых подложек в виде сферических гранул полимерных смол. Это дает ряд преимуществ:

1. Различные исходные соединения могут быть связаны с отдельными гранулами. Затем эти гранулы смешиваются и, таким образом, все исходные соединения могут взаимодействовать с реагентом в одном эксперименте. В результате продукты реакции образуются на отдельных гранулах. В большинстве случаев, смешивание исходных в традиционной жидкой химии приводит обычно к неудачам – полимеризации или осмолению продуктов. Эксперименты на твердой подложке исключают эти эффекты.

2. Поскольку исходные материалы и продукты связаны с твердой подложной, то избыток реагентов и не связанных с подложкой продуктов можно легко отмыть от полимерной твердой подложки.

3. Можно использовать большие избытки реагентов, для того чтобы провести реакцию до конца (больше, чем 99%), поскольку эти избытки легко отделяются.

4. В случае использования низких объемов загрузок (менее 0,8 ммоль на грамм подложки) можно исключить нежелательные побочные реакции.

5. Интермедиаты в реакционной смеси связаны с гранулами и их нет необходимости очищать.

6. Индивидуальные гранулы полимера могут быть разделены в конце эксперимента и таким образом получаются индивидуальные продукты.

7. Полимерная подложка может быть регенерирована в тех случаях, когда подобраны условия разрыва и выбраны соответствующие якорные группы – линкеры.

8. Возможна автоматизация твердофазного синтеза.

Необходимыми условиями проведения твердофазного синтеза, кроме наличия нерастворимой полимерной подложки, инертной в реакционных условиях, являются:

1. Присутствие якоря или линкера – химической функции, обеспечивающей связь подложки с наносимым соединением. Он ковалентно связан со смолой. Якорь также должен являться реакционно-способной функциональной группой для того, чтобы субстраты могли взаимодействовать с ним.

2. Связь, образующаяся между субстратом и линкером должна быть стабильна в условиях реакции.

3. Должны существовать способы разрыва связи продукта или интермедиата с линкером.

Рассмотрим подробнее отдельные компоненты твердофазного метода синтеза: твердая подложка и линкер.

Твердая подложка

Как сказано выше, первыми типами смол, которые использовал Меррифильд, были полистирольные гранулы, где стирол был сшит с 1% дивинилбензола. Гранулы были модифицированы хлорметильными группами (линкер), с которыми аминокислоты могли быть соединены через эфирные группы. Эти эфирные связи стабильны в реакционных условиях, которые применялись для пептидного синтеза.

Одним из недостатком полистирольных гранул является то факт, что они гидрофобны, тогда как растущая пептидная цепь гидрофильна. В результате, иногда растущая пептидная цепь не сольватируется и сворачивается за счет образования внутримолекулярных водородных связей. Такая форма затрудняет доступ новых аминокислот к концу растущей цепи. Поэтому часто используются более полярные твердые подложки, такие как полиамидные смолы. Такие смолы более пригодны для не пептидного комбинаторного синтеза.

Выбор твердой подложки

Синтетические подходы к получению библиотек часто определяются природой выбранной полимерной подложки. Гранулированный полимер должен соответствовать некоторым критериям, в зависимости от стратегий синтеза и скрининга.

Для получаемых библиотек имеют важное значение размер и однородность гранул, а также устойчивость смолы к формированию кластеров. Способность смолы к набуханию в органической и водной среде особенно важна, когда используются обязательные пробы для скрининга структуры, находящейся еще на грануле.

Основные типы полимерных смол для комбинаторного синтеза используемые в настоящее время:

1. Полистирол, сшитый с 0,5-2% дивинилбензола (StratoSpheres)

2. Полиэтиленгликоль, привитый на сшитом сополимере полистирол- 1% дивинилбензол (TentaGel, AgroGel, NovaGel)

3. Полиэтиленгликоль, привитый на 1% сшитый полистирол (PEG-PS)

4. Полистирольная макропористая смола с высокой степью сшивки (AgroPore, TentaPore)

5. Сополимер бис-2-акриламидполиэтиленгликоль-моноакриламидо-полиэтиленгликоль (PEGA)

6. Диметилакриламид нанесенный на макропористую матрицу кизельгура (Pepsyn K)

7. Диметилакриламид нанесенный на макропористую матрицу – сшитый 50% полистирол-дивинилбензол (Polyhipe)

Хотя классические гранулированные смолы больше подходят для комбинаторного синтеза библиотек соединений, иногда используются альтернативные носители.

Например, целлюлоза является хорошей подложкой для многократного “капельного синтеза” пептидов или для синтеза библиотек на бумаге. “Капельные” синтезы проводят путем капания растворов защищенных аминокислот на модифицированную бумагу в присутствии активирующего реагента. Здесь реакционным сосудом является непосредственно носитель и нет необходимости манипуляций, характерных для жидких сред в течение синтеза (обычно встряхивание в случае твердофазного синтеза). Реакция идет за счет диффузии жидкости в носителе. Этот принцип внутреннего объемного синтеза был проверен при использовании полимерных носителей на синтезаторе, использующем центрифугирование для устранение жидкости. Было найдено, что капельная техника сопоставима с классическим функционированием твердой фазы в пептидном синтезе.

Было также найдено, что хлопок (вата), как самая чистая форма целлюлозы может служить удобной подложкой твердой фазы, особенно для множественного синтеза или генерирования библиотеки.

Хотя гранулы и являются наиболее распространенной формой твердой положки, но и другие виды (например, иглы) могут также использоваться для комбинаторного синтеза. Модифицированная стеклянная поверхность также может быть применена для олигонуклеотидного синтеза.

Линкеры

Линкер – это молекулярный фрагмент, ковалентно связанный с твердой подложкой. Он содержит реакционноспособные функциональные группы, с которыми взаимодействует первый реагент и который в результате становится связанным со смолой. Образующаяся связь должна быть стабильной в реакционных условиях, но легко разрываться на конечной стадии синтеза.

Различные линкеры используются в зависимости от того, какая функциональная группа присутствует в субстрате и от того, какая функциональная группа должна быть сформирована в конце процедуры.

В практике комбинаторного синтеза чаще всего используются следующие линкеры:

• Хлорметильный (-CH₂Cl),
• Гидроксильный (-OH),
• Аминный (-NH₂),
• Альдегидный (-CHO),
• Силильный (-OSiR₃).

 

Тип линкера	Тип смолы	Что присоединяет	Что синтезирует	Чем осуществляется разрыв
Галогенметил		Карбоновые кислоты, спирты, фенолы, тиолы, амины	Кислоты, спирты, сложные эфиры, тиоэфиры	TFMSA, H2/Pd, i-Bu2AlH, MeONa, HF
Галогенметил		Алкил и ариламины	Анилиды и сульфамиды	CF3COOH, SOCl2/CF3COOH
Галогенметил		Спирты, кислоты, фенолы, тиолы, амины	Спирты, кислоты, тиолы, амины, сложные эфиры	1-5% CF3COOH, 30% гексафторизопропанол
Гидроксил		Спирты, кислоты	Спирты, кислоты, амиды	CF3COOH, амин/AlCl3, i-Bu2AlH
Гидроксил		Спирты, кислоты	Спирты, кислоты	5% CF3COOH, 10% AcOH
Гидроксил		Кислоты	Кислоты	Свет с длиной волны 365 нм. Линкер стабилен к CF3COOH и пиперидину
Гидроксил		Кислоты	Амиды кислот, спирты, сложные эфиры, гидразиды	Нуклеофилы (NaOH,NH3/MeOH, NaBH4/EtOH, MeOH/CF3COOH, NH2NH2/DMF
Гидроксил		Защищенные пептиды, ки-слоты	Циклические пепти-ды, мочевины	25% CF3COOH, гидразиды
Гидроксил Линкер Ринкера		Спирты, кисло-ты, фенолы	Спирты, кислоты, фенолы	1-5% CF3COOH
Амино		Кислоты	Карбоксамиды	95% CF3COOH
Амино		Кислоты	Защищенные амиды	1% CF3COOH
Амино		Кислоты	Альдегиды и кетоны	LiAlH4 и реактивы Гриньяра
Амино		Карбоновые кислоты	Амиды или карбоновые кислоты	Активация сульфонамида диазометаном или бромацетонитрилом с последующей атакой нуклеофилом амина или гидроксида
Альдегид		Первичные или вторичные спирты	Спирты	95% CF3COOH/H2O или CF3COOH/CH2Cl2/EtOH
Альдегид		Амины	Карбоксамиды, сульфонамиды	CF3COOH

Смолы Ванга могут быть использованы в пептидном синтезе посредством N-защищенной аминокислоты, связанной с линкером эфирной связью. Такая эфирная связь устойчива к сочетанию и стадии снятия защиты, но может быть разрушена трифторуксусной кислотой для снятия конечного пептида с гранулы смолы.

Субстраты с карбоксильной группой могут быть связаны со смолой Ринка через амидную связь. Как только процедура заканчивается, взаимодействие с трифторуксусной кислотой освобождает продукт с первичной амидной группой.

Первичные и вторичные спирты могут быть связаны со смолой, модифицированной дигидропираном. Связывание спирта происходит в присутствии 4-толуолсульфоната в дихлорметане. Снятие продукта происходит с использованием трифторуксусной кислоты.

 

Первый синтез пептидного гормона – окситоцина

В 1953 г. американский ученый Винсент Дю Виньо совместно с сотрудниками выяснил строение окситоцина – циклического полипептида. Cреди известных природных соединений подобные циклические структуры ранее не встречались. В следующем году ученый впервые осуществил синтез этого вещества. Это был первый случай синтеза полипептидного гормона в условиях in vitro.

Дю Виньо известен в научном мире своими исследованиями на стыке химии и медицины. В середине 1920-х гг. предметом его научного интереса было изучение функции серы в инсулине – гормоне поджелудочной железы, регулирующем процесс углеводного обмена и поддержания нормального уровня сахара (глюкозы) в крови. Интерес молодого человека к химии инсулина зародился, по его воспоминаниям, после одной из лекций, прочитанных профессором Уильямом К.Розе сразу же после открытия этого вещества Фредериком Г.Бантингом и Джоном Дж.Р.Маклеодом. Поэтому, когда после окончания университета Джон Р.Мурлин из Рочестерского университета предложил ему заняться изучением химической природы инсулина, молодой ученый посчитал это предначертанным судьбой предложением. «Шанс поработать над химией инсулина перечеркнул все остальные мои научные ожидания, – отмечал впоследствии Дю Виньо, – поэтому я сразу же принял предложение профессора Мурлина».
За время работы в Рочестерском университете Дю Виньо удалось высказать первые предположения о химическом составе инсулина, которые в значительной степени были отражены в его диссертации «Сера инсулина», защищенной в 1927 г. Согласно воззрениям Дю Виньо инсулин являлся одним из производных аминокислоты цистина. Он идентифицировал инсулин как серосодержащее соединение, в котором серные фрагменты представляют собой дисульфидные мостики. Он высказал также соображения о пептидной природе инсулина.
Следует отметить, что данные Дю Виньо о том, что инсулин является серосодержащим соединением, хорошо согласовывались с основными выводами работ, проводимых в то время в этом направлении профессором Джоном Якобом Абелем с сотрудниками в университете Джона Хопкинса. Поэтому стипендия Национального исследовательского совета, которую молодой ученый получил сразу же после защиты диссертации, оказалась очень кстати. Благодаря ей, Дю Виньо работал некоторое время под руководством профессора Абеля в медицинской школе университета Джона Хопкинса.
Профессор Абель, признанный авторитет в области изучения химии гормонов, придерживался в то время точки зрения, что инсулин является белковым соединением. Такие взгляды шли вразрез с доминировавшими в те годы представлениями. Как вспоминал сам Дю Виньо, «это было время, когда как химики, так и биологи никак не могли воспринять тот факт, что энзим может быть белковым соединением». Незадолго до этого профессор Абель смог впервые выделить инсулин в кристаллическом виде (1926). В планы Дю Виньо, когда он устроился на стажировку к Абелю, входило следующее: выделить из кристаллов инсулина аминокислоту цистин и попытаться изучить ее строение. Это ему очень быстро удалось осуществить. В результате исследований совместно с сотрудниками профессора и при его непосредственной помощи молодой ученый наглядно продемонстрировал образование ряда аминокислот при расщеплении молекулы инсулина. Одной из них была как раз серосодержащая аминокислота цистин. При этом опыты показали, что содержание серы в инсулине прямо соотносится с содержанием серы в цистине. Но достигнутые результаты требовали изучения других серосодержащих аминокислот.
Продолжение финансовой поддержки со стороны Национального исследовательского совета еще на один год позволило Дю Виньо посетить известные научные биохимические школы Западной Европы (Дрезден, Эдинбург, Лондон), там он смог получить дополнительный опыт в области изучения пептидов и аминокислот.
По возвращении в США ученый сначала работал в Иллинойском университете, а через три года перешел в медицинскую школу университета Джорджа Вашингтона. Здесь он продолжал свои исследования инсулина. Особенно интересными оказались его работы по изучению влияния дисульфидных связей в цистине на гипогликемический эффект инсулина (понижения сахара в крови). Работы в области инсулина стимулировали также новое направление исследований – изучение гормонов гипофиза.
Важным направлением его работ в университете Джорджа Вашингтона стало изучение механизма конверсии метионина в цистин в живых организмах. В последующие годы именно эти исследования подвели его к проблеме изучения биологического трансметилирования (переноса метильных групп от одной молекулы на другие).
В 1938 г. ученый был приглашен в Медицинский колледж Корнеллского университета. Здесь он продолжил изучение инсулина и развернул исследования по изучению гормонов задней доли гипофизной железы.
В годы второй мировой войны эти исследования пришлось на время прервать. Ученый со своими сотрудниками работал над синтезом пенициллина. По окончании войны Дю Виньо смог вернуться к прежним исследованиям. Особенно интенсивно он занялся работами по выделению ряда гормонов из коммерчески доступных экстрактов гипофиза и тканей гипофиза быка и свиньи.
Задняя доля гипофизной железы вырабатывает ряд гормонов, два из которых к тому времени были выделены в чистом виде. Один из них – окситоцин, стимулирующий гладкую мускулатуру матки, другой – вазопрессин – гормон, сокращающий периферические артериолы и капилляры, тем самым обусловливая повышение давления крови. Эти гормоны, как оказалось, очень трудно различать, т. к. они обладают сходными физическими свойствами. Именно из-за этого до середины 1920-х гг. медики и биохимики считали их одним веществом, обладающим широким спектром биологической активности. Благодаря совершенствованию методов химического анализа, в
частности фракционного осаждения, хроматографии и электрофореза, к 1940-м гг. эти гормоны удалось частично разделить.
В 1949 г. Дю Виньо, применив метод «противоточного распределения» для продажного экстракта, имеющего окситоциновую активность 20 ед/мг, получил препарат с активностью 850 ед/мг. Это сподвигло ученого предпринять попытку изучить строение вещества. С этой целью он осуществил фрагментацию полипептидной цепи. В результате полного гидролиза препарата окситоцина и данных анализа его аминокислотного состава Дю Виньо было установлено наличие восьми различных аминокислот в эквимолекулярном соотношении. Количество выделившегося аммиака соответствовало трем амидным группам типа
–CONH₂, молекулярная масса – мономерному октапептиду. Один из восьми аминокислотных остатков был идентифицирован как цистин. Опыты по окислению цистина в окситоцине показывали, что обнаруженный ранее Дю Виньо дисульфидный мостик в цистине является частью кольцевой системы окситоцина.
Последовательность восьми аминокислот в окситоцине была установлена Дю Виньо с сотрудниками окончательно лишь в 1953 г. Следует отметить, что параллельно группе Дю Виньо над теми же проблемами в Вене работал профессор Ганс Туппи (Венский университет), который также в 1953 г. независимо от Дю Виньо установил последовательность аминокислот в окситоцине, использовав в своей работе метод Сенгера.
Дю Виньо шел несколько иным путем. Он и его сотрудники основывались главным образом не на анализе концевых аминокислот, а на идентификации компонентов большого числа низших пептидов. Они исследовали также реакцию окисленного окситоцина с бромной водой, в результате которой образовывались гептапептид и бромированный пептид. Изучение строения последнего показывало, что последовательность аминокислот в соответствующем дипептиде: цистин – тиразин.
Далее динитрофенильным методом было установлено, что N-концевой аминокислотой в гептапептиде является изолейцин. По заключению Дю Виньо из этого вытекает, что N-концевая последовательность в окисленном окситоцине:

HO₃S – цис – тир – изл.

Аминокислоты из гормона окситоцина

Из тринадцати перечисленных ниже пептидов первые четыре были получены частичным гидролизом гептапептида, вторая группа – гидролизом окситоцина (при этом цистеиновые остатки превращались в остатки аланина). Затем отделяли нейтральную фракцию и обрабатывали бромной водой для окисления цистеинового звена в звено цистеиновой кислоты; полученный кислый пептид отделяли от нейтрального на ионнообменных смолах. Третья группа пептидов была получена гидролизом окситоцина, десульфированного на никеле Ренея. В приводимых ниже формулах, если последовательность аминокислот в пептидах известна, символы аминокислот разделены тире; если последовательность неизвестна, то символы разделены запятой.

Из гептапептида:

1. (асп – цис – SO₃H).
2. (цис – SO₃H, про).
3. (цис – SO₃H, про, лей).
4. (цис – SO₃H, про, лей, гли).

Из окситоцина:

5. (лей, гли, про).
6. (тир, цис – S – S – цис, асп, глу, лей, изл).
7. (тир, цис – S – S – цис, асп, глу).
8. (цис – S – S – цис, асп, глу).
9. (цис – SO₃H, асп, глу).

Из десульфированного окситоцина:

10. (ала, асп).
11. (ала, асп, глу).
12. (глу, изл).
13. (ала, асп, глу, лей, изл).

Учитывая строение полученных пептидов и используя наложение отдельных компонентов пептидов, Дю Виньо с сотрудниками вывел следующую последовательность аминокислот в окситоцине:

цистин – тиразин – изолейцин – глутамин – NH₂ – аспарагин – NH₂ – цистин – пролин – лейцин – глицин – NH₂.

Установленная ими структура окситоцина представлена на рис. 1.

Рис.1. Структура окситоцина, определенная Дю Виньо с сотрудниками

Следует отметить, что одновременно с окситоцином Дю Виньо была определена структура другого гормона задней доли гипофиза – вазопрессина.
Структура гормона окситоцина была подтверждена его химическим синтезом в 1954 г., что являло собой впервые осуществленный полный синтез природных пептидов. Синтез включал конденсацию N-карбобензокси-S-бензилдипептида (I) с триамидом гептапептида (II) с помощью тетраэтилпирофосфита. После удаления карбобензокси- и бензильных групп, защищавших амино- и сульфгидрильные группы соответственно в обоих пептидах, образовавшийся нонапептид окисляли воздухом, в результате чего был получен окситоцин (рис. 2).
Так были осуществлены первый структурный анализ и первый синтез полипептидного гормона – выдающееся достижение в биохимии и медицине. С работ Дю Виньо в науке началась эра химического синтеза биологически активных природных пептидов.

Рис.2. Общая схема синтеза окситоцина по Дю Виньо

Как известно, в 1955 г. Дю Виньо была вручена Нобелевская премия по химии «за работу с биологически активными соединениями, и прежде всего за впервые осуществленный синтез полипептидного гормона».

 

 

Синтез инсулина в клетке

Инсули́н — гормон пептидной природы, образуется в бета-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы. Оказывает многогранное влияние на обмен практически во всех тканях. Основное действие инсулина заключается в снижении концентрации глюкозы в крови.

Инсулин увеличивает проницаемость плазматических мембран для глюкозы, активирует ключевые ферменты гликолиза, стимулирует образование в печени и мышцах из глюкозы гликогена, усиливает синтез жиров и белков. Кроме того, инсулин подавляет активность ферментов, расщепляющих гликоген и жиры. То есть, помимо анаболического действия, инсулин обладает также и антикатаболическим эффектом.

Нарушение секреции инсулина вследствие деструкции бета-клеток — абсолютная недостаточность инсулина — является ключевым звеном патогенеза сахарного диабета 1-го типа. Нарушение действия инсулина на ткани — относительная инсулиновая недостаточность — имеет важное место в развитии сахарного диабета 2-го типа.

 

 

Посттрансляционные модификации инсулина. 1) Препроинсулин (L - лидерный пептид, B - участок 1, C - участок 2, А - участок 3) 2) Спонтанный фолдинг 3) Образование дисульфидного мостика между А и В 4) Лидерный пептид и C отрезаются 5) Конечная молекула

Синтез и выделение инсулина представляют собой сложный процесс, включающий несколько этапов. Первоначально образуется неактивный предшественник гормона, который после ряда химических превращений в процессе созревания превращается в активную форму. Инсулин вырабатывается в течение всего дня,а не только в ночные часы.

Ген, кодирующий первичную структуру предшественника инсулина, локализуется в коротком плече 11 хромосомы.

На рибосомах шероховатой эндоплазматической сети синтезируется пептид-предшественник — препроинсулин. Он представляет собой полипептидную цепь, построенную из 110 аминокислотных остатков и включает в себя расположенные последовательно: L-пептид,B-пептид, C-пептид и A-пептид.

Почти сразу после синтеза в ЭПР (эндоплазматический ретикул-эндоплазматическая сеть) от этой молекулы отщепляется сигнальный (L) пептид — последовательность из 24 аминокислот, которые необходимы для прохождения синтезируемой молекулы через гидрофобную липидную мембрану ЭПР. Образуется проинсулин (полипептид, производимый бета-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы.

Проинсулин является предшественником в процессе биосинтеза инсулина. Он состоит из двух цепей, имеющихся в молекуле инсулина (А-цепь и В-цепь), соединённых C-пептидом или (С-цепью, соединительной цепью), которая отщепляется в процессе образования инсулина от молекулы проинсулина), который транспортируется в комплекс Гольджи, далее в цистернах которого происходит так называемое созревание инсулина.

Созревание является наиболее длительным этапом образования инсулина. В процессе созревания из молекулы проинсулина с помощью специфических эндопептидаз вырезается C-пептид — фрагмент из 31 аминокислоты, соединяющий B-цепь и A-цепь. То есть молекула проинсулина разделяется на инсулин и биологически инертный пептидный остаток.

В секреторных гранулах инсулин, соединяясь с ионами цинка, образует кристаллические гексамерные агрегаты.

Инсулин оказывает на обмен веществ и энергии сложное и многогранное действие. Многие из эффектов инсулина реализуются через его способность действовать на активность ряда ферментов.

Инсулин — единственный гормон, снижающий содержание глюкозы в крови, это реализуется через:

· усиление поглощения клетками глюкозы и других веществ;

· активацию ключевых ферментов гликолиза;

· увеличение интенсивности синтеза гликогена — инсулин форсирует запасание глюкозы клетками печени и мышц путём полимеризации её в гликоген;

· уменьшение интенсивности глюконеогенеза — снижается образование в печени глюкозы из различных веществ

Анаболические эффекты:

· усиливает поглощение клетками аминокислот (особенно лейцина и валина);

· усиливает транспорт в клетку ионов калия, а также магния и фосфата;

· усиливает репликацию ДНК и биосинтез белка;

· усиливает синтез жирных кислот и последующую их этерификацию — в жировой ткани и в печени инсулин способствует превращению глюкозы в триглицериды; при недостатке инсулина происходит обратное — мобилизация жиров.

Антикатаболические эффекты:

· подавляет гидролиз белков — уменьшает деградацию белков;

· уменьшает липолиз — снижает поступление жирных кислот в кровь.

Заключение

Действительно, первый полный синтез пептида, гормона окситоцина (1953 г), содержащего всего 8 аминокислотных остатков, рассматривался как выдающееся достижение, принесшее его автору, В. дю Виньо, Нобелевскую премию 1955 г. Однако уже в следующие двадцать лет синтезы полипептидов подобной сложности превратились в рутину, так что в настоящее время синтез полипептидов, состоящих из 100 и более аминокислотных остатков, уже не рассматривается как непреодолимо трудная задача. Использование новых методов позволило осуществить синтез гормона инсулина и других гормонов. В данной работе ознакомились с понятием «полипептидов», разобрали и объяснили, что вызвало столь драматические изменения в области синтеза полипептидов. Ознакомились с синтезом пептидов и их твердофазным синтезом.

 

 

Литература

1.Plane R. Interview with Vincent du Vigneaud. Journal of Сhemical Education, 1976, v. 53, №1, p. 8–12;
2. Du Vigneaud V. A Trail of Research in Sulfur Chemistry and Metabolism and Related Fields. Ithaca, New York: Cornell University Press, 1952;
3. Bing F. Vincent du Vigneaud. Journal of Nutrition, 1982, v. 112, p. 1465–1473;
Du Vigneaud V., Melville D.B., Gyo..rgy P., Rose K.S. Identity of Vitamin H with Biotin. Science, 1940, v. 92, p. 62–63; Лауреаты Нобелевской премии. 4.Энциклопедия. Пер. с англ. Т. 2. М.: Прогресс, 1992

5. http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%98%D0%BD%D1%81%D1%83%D0%BB%D0%B8%D0%BD#.D0.A1.D0.B8.D0.BD.D1.82.D0.B5.D0.B7_.D0.B8.D0.BD.D1.81.D1.83.D0.BB.D0.B8.D0.BD.D0.B0_.D0.B2_.D0.BA.D0.BB.D0.B5.D1.82.D0.BA.D0.B5

6. http://www.chem.isu.ru/leos/base/comb/comb03.html