Кинетика реакций, катализируемых ферментами

 

Биохимические реакции в биологических системах редко протекают в отсутствие катализатора. Роль таких катализаторов выполняют специфические белки, называемые ферментами. Ферменты обладают высокой специфичностью как в отношении катализируемой ими реакции, так и в отношении субстратов, т.е. участвующих в реакции веществ. Превращение вещества каким-либо ферментом предшествует формирование фермент-субстратного комплекса (ES). При высоких концентрациях субстрата весь фермент будет в комплексе с субстратом и скорость реакции будет максимальной.

На рисунке 1. показана зависимость скорости ферментативного катализа v от концентрации субстрата [ S ]. При постоянной концентрации фермента и малых значениях [ S ] скорость прямо пропорциональна [ S ], реакция протекает в соответствии с уравнением первого порядка. При высоких значениях [ S ] скорость почти не зависит от [ S ], реакция протекает в соответствии с уравнением нулевого порядка.

Рис. 1. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.

 

Л.Анри первым предложил модель, объясняющую такую кинетику.

Обозначим фермент – Е, а субстрат – S. Ферментативная реакция будет идти в две стадии:

k₁

E + S ↔ ES (быстрая стадия)

k_--1

 

k₂

ES → продукты + Е (медленная стадия)

 

Как видно из этих уравнений, фермент Е взаимодействует с субстратом S с образованием фермент-субстратного комплекса ES. Константа скорости прямой реакции – k₊₁, а константа обратной – k_-1. Затем фермент-субстратный комплекс распадается с образованием продукта реакции, а катализатор остается в первоначальном состоянии. Константа скорости распада комплекса ES с образованием продукта – k₊₂. Поскольку комплекс ES способен диссоциировать, можно записать выражение равновесной константы диссоциации комплекса, K_S, которая равна отношению констант скоростей обратной и прямой реакций:

k _-1

K_S = ——

k₁

 

Стадией, определяющей скорость процесса, будет стадия распада комплекса на фермент и продукт. Она носит название лимитирующей стадии всего процесса.

Скорость реакции образования комплекса ES

v = k₊₁ [ E ][ S ],

а скорость распада комплекса

v = k_-1 [ ES ]

 

При равенстве этих скоростей получим выражение:

 

k₊₁ [ E ][ S ] = k_-1 [ ES ]

 

Разделив обе части уравнения на величину k₊₁, получим:

 

[ E ][ S ] = k_-1 / k₊₁ [ ES ],

 

где k_-1 / k₊₁ представляет собой K_S. Таким образом, после приведенного преобразования выражение приобретает вид:

 

[ E ][ S ] = K_S [ ES ]

 

В этом уравнении величину [ E ] можно записать как [ E₀ ] – [ ES ], что представляет собой концентрацию свободного фермента за вычетом концентрации фермента, связанного с субстратом. [ E₀ ] – это общая концентрация фермента в начале реакции.

 

[ S ] ([ E₀ ] – [ ES ]) = K_S [ ES ]

 

После преобразования последнего уравнения получаем:

[ S ]

[ ES ] = [ E₀ ] ————

K_S + [ S ]

 

Максимальная скорость ферментативной реакции достигается в ситуации, когда концентрация комплекса ES равна начальной концентрации фермента Е₀ т.е. [ ES ] = [ E₀ ]. Таким образом, можно записать следующую зависимость:

V₀ [ ES ]

—— = ——

V_max [ E₀ ]

 

Поскольку из предыдущего выражения следует, что:

 

[ ES ] [ S ]

—— = ————

[ E₀ ] K_S + [ S ]

то получаем:

V₀ [ S ] [ S ]

—— = ———— или V₀ = V_max————

V_max K_S + [ S ] K_S + [ S ]

 

Это последнее уравнение получило название уравнения Михаэлиса-Ментен. Графически зависимость между концентрацией субстрата и скоростью реакции отображает рис. 1.

Следует, однако, помнить, что уравнение Михаэлиса-Ментен справедливо только для начального времени реакции, когда присутствует избыток субстрата и образуется небольшое количество продукта. Именно поэтому уравнение Михаэлиса-Ментен носит несколько ограниченный характер, поскольку оно учитывает только первую часть процесса, так как истинное равновесие не может быть достигнуто. В связи с этим Холдейном и Бриггсом было предложено усовершенствованное выражение уравнения Михаэлиса-Ментен, учитывающее стадию превращения субстрата в продукт:

[ S ]

V₀ = V_max ————

K_m + [ S ]

где К_m – константа Михаэлиса, которая равна концентрации субстрата (выраженной в молях/литр), при которой скорость реакции составляет половину максимальной скорости. Численное значение константы Михаэлиса может быть выражено следующим образом:

 

k _-1 + k₂

K_m = ————

k₁

 

Преобразованное Холдейном и Бриггсом уравнение Михаэлиса–Ментен, которое имеет выражение

V_max [ S ]

V = ————

K_m + [ S ]

 

описывает поведение многих ферментов при измене­нии концентрации их субстратов. Используя это урав­нение можно рассмотреть несколько ситуаций, отражающих влияние [ S ] и К_m на начальную скорость фермента­тивной реакции:

 

1. Значение [ S ]намногоменьше величины К_m (точка А на рис. 1). В этом случае величину [ S ] в знаменателе можно опу­стить, и он будет практически равен величине К_m. Отношение двух постоянных величин - V_max и К_m, можно заменить новой константой К. Таким образом, имеем:

 

V_max [ S ] V_max [ S ]

V = ————; V @ ———— @ K [ S ]

K_m + [ S ] K_m

 

(@ означает «примерно равно»).

Другими словами, когда концентрация субстрата значительно ниже величины К_m - начальная скорость реакции, V_о, пропорциональна концентрации субстрата [S];

 

2. Значение [ S ]намногобольше величины К_m (точка С на рис. 1). Тогда величиной К_m в знаменателе можно пренебречь, т.е.

 

V_max [ S ] V_max [ S ]

V = ————; V @ ———— @ V_max

K_m + [ S ] [ S ]

 

Это означает, что при концентрации субстрата [S], намного превышающей К_m, начальная скорость V_о приближается к максимальной скорости V_max и не зависит от концентрации субстрата;

 

3. Наконец, при равенстве величин [ S ] и К_m (точка В на рис. 1) в знаменателе уравнения Михаэлиса-Ментен получим удвоенное значение [ S ].

 

V_max [ S ] V_max [ S ] V_max [ S ] V_max

V = ————; V = ———— = ——— = ——

K_m + [ S ] [ S ] + [ S ] 2 [ S ] 2

 

Это означает, что при концентрации субстрата, равной К_m, начальная скорость реакции V_о составляет половину максимальной скорости - V_max.

 

 

Графическое определение К_М и V_max

Так как уравнение Михаэлиса-Мэнтен является уравнением гиперболы, графически определить постоянные величины К_М и V_max довольно трудно. Поэтому уравнение Михаэлиса-Мэнтен преобразуют в уравнение прямой. Одна из них – уравнение Лайнуивера-Берка, в котором уравнение Михаэлиса-Мэнтен выражено в виде обратных величин:

 

1 K_M + [ S ] 1 K_M 1

— = ———— или — = ———— + ——

V V_max [ S ] V V_max [ S ] V_max

Строя график 1/V от 1 /[ S ] получим прямую линию с наклоном, равным K_M/V_max, пересекающую ось 1/V в точке 1/V_{max ,} а ось 1 /[ S ] - в точке (-1/К_М) (рис. 2).

K_m имеет ту же размерность, что и [ S ]. Линейность графикаЛайнуивера–Берка позволяет определять K_m по отно­сительно небольшому числу точек, поэтому он часто используется для расчета этого параметра. Знание величины K_m позволяет определить, какое количество субстрата следует внести в реакционную смесь для определения V_max. Графики, построенные в обратных координатах, находят широкое примене­ние при анализе характера действия ингибиторов на ферментативные реакции.

 

Физический смысл величин К_М и V_max

Физический смысл константы Михаэлиса K_m заключается в том, что она численно равна концентрации субстрата, при которой активность фермента составляет половину максимальной.

Максимальная скорость V_max отражает число оборотов фермента, если не известна концентрация активных центров [ E ], поскольку V_max = k₂ · [ E ].

Кинетическая константа k₂ называется числом оборотов. Число оборотов фермента – это то количество молей субстрата, которое превращается в продукт реакции в единицу времени при полном насыщении фермента субстратом.

 

 

Рис. 2. График Лайнуивера–Берка в двойных обратных координатах (зависимость 1/V_о от 1/[S]), используемый для графического определения K_m и V_max.

 

 

Контрольные вопросы

 

1. Кинетика реакций, катализируемых ферментами

2. Уравнение Михаэлиса–Ментен

3. Графическое определение К_m и V_max, график Лайнуивера–Берка.

4. Физический смысл величин К_m и V_max

Литература

27. Киселев П.А., Бокуть С.Б. Курс лекций по физической химии, Учебное пособие, Минск, МГЭУ им. А.Д. Сахарова, 2005, 141 С.

28. Киселев П.А., Бокуть С.Б. Курс лекций по коллоидной химии, Учебное пособие, Минск, МГЭУ им. А.Д. Сахарова, 2005, 54 С.

29. Бокуть С.Б., Подобед Л.Ф., Киселев П.А., Сборник задач по физической и коллоидной химии, Учебное пособие, Минск, МГЭУ, 2007, 99 С.,

30. Стромберг А.Г., Семченко Д.П. Физическая химия. М.: Высшая школа, 2003.

31. Физическая химия. Под ред. Краснова К.С. М.: Высшая школа, 1982.

 

Ход работы

Задание

Методом разностной спектрофотометрии определить влияние различных концентраций додецилсульфата натрия на процесс окисления гемоглобина в метгемоглобин. Определить величину кажущейся константы диссоциации, KS, отражающей взаимодействие додецилсульфата натрия с молекулами гемоглобина

1. Приготовить исходный раствор гемоглобина с концентрацией 5 ∙ 10^-5 М, добавляя к навеске гемоглобина (32 мг) 10 мл 0,05 М натрий-фосфатного буфера рН 7,4;

2. Приготовить рабочий раствор гемоглобина с концентрацией 10^-6 М объемом 15 мл. Добавить 2 мл данного раствора в спектрофотометрическую кювету и записать его как базовую линию;

3. Приготовить растворы объемом 2 мл, содержащие 10^-6 М гемоглобина и 1,5; 3; 4,5; 6; 7,5 ∙ 10^-6 М SDS. Смеси инкубировать 5 мин при комнатной температуре и относительно базовой линии зарегистрировать разностный спектр;

4. Разностный спектр имеет максимум на 401 нм и минимум на 420 нм, что показывает изменение величины поглощения в области полосы Соре, которое указывает на переход метгемоглобина в его низкоспиновую форму - гемихром. Определяют параметр Δ D между λ_max и λ_min.

5. Рассчитать значения 1/[SDS] и 1/Δ D. Данные занести в таблицу.

6. Методом двойных обратных величин в координатах Лайнуивера-Берка (1/Δ D от 1/[SDS]) определить значение кажущейся константы диссоциации K_s, отражающей взаимодействие додецилсульфата натрия с молекулами гемоглобина.

 

Таблица

№ опыта	[SDS], мкМ	Δ D	1/[SDS], мкМ-1	1/Δ D
1.	1,5
2.	3,0
3.	4,5
4.	6,0
5.	7,5

 

Оформление работы

К занятию:

1. Кратко законспектировать теоретический материал по лабораторной работе.

Во время занятия:

2. Описать этапы работы.

3. Заполнить таблицу.

4. Начертить калибровочные графики.

5. Оформить результаты измерений.

6. Сделать выводы.