Определение диастазного числа

Метод основан на колориметрическом определении количества субстрата, расщепленного в условиях проведения ферментативной реакции, и последующем вычислении диастазного числа.

Диастазное число характеризует активность амилолитнических ферментов меда.

Диастазное число выражают количеством кубических сантиметров раствора крахмала массовой долей 1 %, которое разлагается за 1 ч амилолитическими ферментами, содержащимися в 1 г безводного вещества меда.

1 см³ раствора крахмала соответствует 1 единице активности.

Подготовка к испытанию

Приготовление ацетатного буферного раствор. Ацетатный буферный раствор концентрации 0,2 моль/дм³ с рН 5,0 готовят, смешивая одну объемную часть раствора уксусной кислоты и три объемные части раствора уксуснокислого натрия. В полученном буферном растворе растворяют 2,4-динитрофенол с таким расчетом, чтобы его концентрация в комбинированном реактиве составила 0,05%. Проверяют рН раствора потенциометрически и в случае отклонений от рН 5,0 показатель корректируют, добавляя раствор уксусной кислоты концентрации 0,2 моль/дм³ или раствор уксуснокислого натрия концентрации с (СН₃ СООNа) = 0,2 моль/дм³.

Приготовление комбинированного реактива. Комбинированный реактив готовят из восьми объемных частей раствора крахмала, пяти объемных частей буферного раствора с 2,4-динитрофенолом и одной объемной части раствора хлористого натрия.

При приготовлении комбинированного реактива в количестве, равном или большем 1дм³, объем соответствующих растворов отмеривают с погрешностью не более 0,5 см³.

Полученную смесь тщательно встряхивают.

Комбинированный реактив хранят при комнатной температуре не более 3мес.

Приготовление раствора меда. 5г меда, взвешенного с погрешностью не более 0,01г, растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 50 см³. 1 см³ такого раствора содержит 0,1г меда.

Приготовление раствора крахмала. 0,25г крахмала, взвешенного с погрешностью не более 0,001 г, размешивают в стаканчике вместимостью 50см³ с 10-20см² дистиллированной воды и количественно переносят в коническую колбу, где не сильно кипит 80-90см³ дистиллированной воды.Кипение продолжается 2-3мин. Колбу охлаждают до 20 ºС, содержимое количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят до метки

. Проведение испытания В сухую пробирку отмеряют из бюретки 14,0см³ комбинированного реактива. Пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают на 10 мин в водяную баню при температуре 40 ºС. Затем в пробирку вносят пипеткой 1,0 см³ раствора меда. Содержимое перемешивают пятикратным перевертыванием, и пробирку вновь помещают на водяную баню, одновременно включая секундомер. Пробирку выдерживают на водяной бане в течение 15 мин при температуре (40±0,2) ºC.

Пипеткой отбирают 2,0см³ реакционной смеси, вносят ее при перемешивании в мерную колбу вместимостью 50см³, содержащую 40см³ воды и 1см³ раствора йода, температурой 20ºС. Раствор доводят водой до метки. Колбу закрывают пробкой, содержимое хорошо перемешивают и выдерживают на водяной бане при 20 ºС в течение 10мин.

Одновременно проводят контрольный опыт, заменяя раствор меда дистиллированной водой.

Оптическую плотность измеряют на фотоэлектроколориметре против воды при светофильтре длиной волны 582 или 59 нм, используя кювету рабочей длиной 1,0см. Колориметрируя растворы, определяют значения оптической плотности испытуемого раствора Д_исп и контрольного опыта Д_к с точностью отсчета 0,001.

Диастазное число меда Х₄ в пересчете на 1 г безводного вещества вычисляют по формуле

(5)

где.D_k – оптическая плотность раствора, определенная контрольным опытом;

D_исп – оптическая плотность испытуемого раствора;

80 – коэффициент пересчета;

W – массовая доля воды в меде, %.

За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений. Допускаемые расхождения между результатами параллельных определений не должны превышать 0,5ед. Готе в интервале от 0 до 10ед.