Тема: Приготування поживного середовища для культивування Agrobacterium tumefaciens

Мета роботи: нарощування Agrobacterium tumefaciens та використання її для трансформації рослинних клітин і виділення Ті-плазміди.

Загальні відомості: Генетичну інженерію складає система прийомів, які дозволяють лабораторним шляхом конструюват и штучні генетичні структури у вигляді рекомбінантних (гібридних) молекул: ДНК. Суть генетичної інженерії полягає в переміщені окремих генів із одного генетичного оточення в інше, що призводить до різних фенотипових змін в клітині.

Основними проблемами генетичної інженерії є:

1. Вибір векторів і експресія чужорідних генів, тобто вирішення питання про те, як індукувати або регулювати експресію чуже-рідних генів в рослинній клітині.

2. Отримання в кінцевому результаті нормальних здорових рос­лин, здатних до розмноження.

3. Вибір і виділення генів рослинного або іншого походження, введення яких призводить до появи нових помітних змін у рослин.

Основні етапи генетичної інженерії зводяться до того, що із набору рестрикційних фрагментів ДНК, які містять потрібний ген, збирається компактна генетична структура - ДНК, яка потім вводиться в клітину. Нова генетична інформація експресується, що призводить до синтезу відповідного продукту, який кодується клонуючим геном. Таким чином, вводячи в клітину нову генетичну інформацію в вигляді гібридних молекул ДНК, можна отримати рослину, яка буде змінена відповідне поставленій меті.

Сучасні методи перенесення генів в рослину можна поділити таким чином: методи введення генів за допомогою природних векторів (на основі Ті-плазмід Agrobacterium tumefaciens, Ri-плазміди А. гкііоіепеs, транспозованих елементів, вірусів і віроїдів), прямі методи введення чужорідної ДНК в геном вищих рослин (пряма трансформація протопластів, мікроін'єкцій, електропорація, упакування ДНК в ліпосоми, біолистика).

Ті-плазміди - це- природні вектори для трансформації клітин вищих рослин, і вчені використовують їх для експериментального введення нових генів в рослину. Онкогена Т-ДНК не задіяні в переносі та інтеграції самих себе в ядерну ДНК рослинних клітин. Ці гени можна замінити, а на їх місце вбудувати чужерідну ДНК, яка містить новий ген і гени-маркери стійкості до антибіотиків (для фенотипового тестування трансформації).

Метод біолистики: у спеціальному пристрої при невеликому вакуумі здійснюють бомбардування тканин рослини вольфрамовими мікрочастинками розміром 4 мкм, які зверху покривають РНК, ДНК вірусу.

ХІД РОБОТИ

1. 250 г очищеної картоплі заливають 400 мл водопровідної води. Варять на слабому вогні протягом 10 хв.

2. Картопляний відвар фільтрують через чотири шари марлі та додають 2,5 г ИаСІ.

3. Наважку агару (10 г) заливають 100 мл водопровідної води і залишають на 30 хв. для набухання. Потім доводять до кипіння та додають до картопляного відвару. Доводять загальний об'єм середовища до 500 мл.

4. Розливають тале середовище в попередньо простерилізовані пробірки по 5 мл, закривають ватними пробками та стерилізують при 1атм протягом 20 хв.

5. Після стерелізаціїї пробірки кладуть під кутом 15-20 для отримання скошеного агару.

6. Після застигання на агар з допомогою петлі висівають невелику кількість Agrobacterium tumefaciens.

7. Через 48 годин вирощені таким чином бактерії використовують для трансформації рослинних клітин та виділення Ті-плазміди.

 

 

Матеріали та обладнання: стерильні бактеорологічні пробірки, колби хімічні стакани, спиртівка, петля для посіву бактерії, ламінар-бокс, картопляний відвар, хлористий натрій, агар-агар.

 

Питання для контролю:

1. Що таке Ті-плазміди?

2. Які основні проблеми генетичної інженерії?

3. В чому полягає метод біолистики?

4. Як можна поділити методи перенесення генів в рослину?

Література:

1. В.О. Слободян Основи біотехнології. Навчальний посібник. – Івано-Франківськ: ІМЕ «Галицька академія»,2006-200с.

2. В.Г. Герасименко Біотехнологія. Підручник / В.Г. Герасименко. – К.: Фірма «ІНКОС», 2006. – 647с.

3. В. Вакула Биотехнология: что это такое? – Москва «Молодая гвардия» 1989. – 264с.