Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных Streptococcus pneumoniae

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мокрота, аспират из трахеи и бронхов, промывные воды бронхов, экссудат из плевральной полости, кровь, спинномозговая жидкость при менингите, отделяемое зева и носа при ОРЗ.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. Мазки для первичной бактериоскопии готовят из патологического материала, за исключением крови, и окрашивают по методу Грама. Наличие в них грамположительных диплококков несколько удлиненных, имеющих ланцетовидную форму (0,5—1,25 мкм), окруженных капсулой (рис. 14.1.1; на вклейке), позволяет поставить предварительный диагноз.

Бактериологическое исследование. Материал засевают на кровяной агар и/или на сахарный бульон с добавлением сыворот-"кй крови. После инкубации при 37 °С через 24 ч на агаре образуются мелкие нежные колонии, окруженные небольшой зеленоватой зоной гемолиза. Из колоний делают мазки для изучения морфологии и тинкториальных свойств, а затем пересевают на скошенный кровяной агар или сывороточный бульон для выделения чистой культуры.

Для дифференциации S.pneumoniae от S.pyogenes проверяют чувствительность выделенной культуры к желчи и оптохину и ферментацию инулина.

Серотипирование осуществляют в реакции агглютинации с типоспецифическими сыворотками (из более 80 известных вариантов в патологии человека ведущую роль играют 23 основных серовара). Экспресс-методом серотипирования S.pneumoniae является реакция Нейфельда, которая основана на феномене набухания капсулы стрептококка в присутствии типоспе-цифической сыворотки.

Биопроба. Для выделения чистой культуры S.pneumoniae в некоторых случаях материал вводят внутрибрюшинно белым мышам, которые являются высокочувствительными к данному микроорганизму. Культуру стрептококка выделяют из крови и органов погибшего или забитого животного, а также проводят бактериоскопию мазков-отпечатков, сделанных из его органов. В настоящее время метод практически не применяют.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. Для обнаружения специфического антигена S.pneumoniae в спинномозговой жидкости пациентов при менингите используют реакции непрямой латекс-агглютинации, РНГА и др.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.

• Микробиологическая диагностика респираторных инфекций, вызванных Klebsiella pneumoniae

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мокрота, промывные воды бронхов, экссудат из плевральной полости, кровь, спинномозговая жидкость при менингите, отделяемое зева и носа при ОРЗ; слизь и соскобы из носа при склероме.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. Мазки для первичной бактериоскопии готовят из патологического материала, окрашивают по методу Грама и Бурри—Гинса. Наличие в мазках грамотрицательных капсульных бактерий (см. рис. 2.2.5) позволяет сделать предварительное заключение. В случае склеромы при гистологическом исследовании гранулематозной ткани, взятой из носа, обнаруживаются своеобразные гигантские клетки Микулича, в которых содержатся клебсиеллы.

Бактериологическое исследование. Материал засевают на чашки Петри с питательным агаром, содержащим пенициллин для подавления роста сопутствующей микрофлоры, или на дифференциально-диагностические среды с лактозой и бром-тимоловым синим. На питательном агаре клебсиеллы образуют блестящие выпуклые слизистые колонии. На дифференциальной бромтимоловой среде колонии K.pneumoniae подвида rhi-noscleromatis и K.pneumoniae подвида ozaenae, не расщепляющие лактозу, окрашены в цвет среды (голубой), а на бромкрезоло-вой — в фиолетовый. Лактозоположительные K.pneumoniae подвида pneumoniae образуют колонии желтого цвета. На 2-й день из подозрительных колоний делают мазки, окрашивают их по методу Грама, Бурри—Гинса и пересевают на скошенный агар или среду Ресселя (см. тему 13.1) для получения чистой культуры. На 3-й день учитывают рост на агаре и среде Ресселя. Лактозоотрицательные бактерии окрашивают только столбик среды в красный цвет, а лактозоположительные — всю среду и часто разрывают среду в результате газообразования при ферментации глюкозы. Идентификацию выделенной культуры проводят по наличию капсулы, отсутствию подвижности и

другим признакам. Для установления серовара выделенной культуры проводят реакцию агглютинации или иммунофлюо-ресценции с типоспецифическими противокапсульными сыворотками.

Экспресс-методы диагностики: биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика. Проводят с сыворотками больных людей в РСК или РИГА с целью ретроспективной диагностики.

• Количественное микробиологическое исследование при пневмониях и ОРЗ

Оценка результатов микробиологических исследований при воспалительных заболеваниях дыхательной системы, когда высеваются разнообразные условно-патогенные микроорганизмы, представляет определенные трудности, так как многие из этих бактерий входят в состав нормальной микрофлоры верхних дыхательных путей. Поэтому в качестве дополнительного метода используют количественный микробиологический учет. Исследуемый материал (мокроту) предварительно гомогенизируют в банке со стеклянными бусами, в ступке с кварцевым песком или с помощью магнитной мешалки. Готовят десятикратные разведения материала от 10"¹ до 10"⁷ и по 0,1 мл соответствующего разведения засевают на питательные среды, состав которых зависит от предполагаемых групп микроорганизмов (кровяной агар, ЖСА, среда Эндо, среда Сабуро и др.). После инкубации в термостате подсчитывают число выросших колоний, идентифицируют микроорганизмы и оценивают полученные результаты.

При воспалительных заболеваниях дыхательной системы увеличивается количественное содержание условно-патогенных микроорганизмов в 1 мл мокроты или промывных вод бронхов. Количественные показатели, которые нехарактерны для организма здоровых людей, имеют диагностическое значение и указывают на этиологическую роль микроорганизмов: S.pneumoniae, H.influenzae — 10⁶, Staphylococcus spp. — 10⁵, En-terobacter — 10⁴, Candida spp. — 10³ и более колониеобразую-щих единиц (КОЕ) в 1 мл. В случаях доминирования отдельных видов в микробных ассоциациях, особенно при повторных исследованиях, а также при наличии эпидемиологических данных эти диагностические критерии могут быть снижены на один порядок. Сочетание качественного и количественного микробиологического исследования позволяет получить достоверные результаты.

Рис. 14.1.2. Колонии Mycoplasma pneumoniae на агаре с лошадиной сывороткой; имеют типичный вид яичницы-глазуньи.

• Микробиологическая диагностика атипичных пневмоний, вызванных Coxiella burnetii, Chlamydophila spp. и Mycoplasma pneumoniae

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мокрота, промывные воды бронхов.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. Не применяется, поскольку малые размеры возбудителей не позволяют использовать метод световой микроскопии.

Бактериологическое исследование. Бактериологическая диагностика пневмоний, вызванных перечисленными микроорганизмами, применяется сравнительно редко. Риккетсии и хламидий не растут на искусственных питательных средах. Для их культивирования используют куриные эмбрионы или культуры клеток. Выделение риккетсии и хламидий требует длительного времени и не всегда бывает успешным.

Чистую культуру С.burnetii идентифицируют по морфологии бактерий, способности к внутриклеточному росту, отсутствию роста на питательных средах и по антигенным свойствам. Культуры хламидий идентифицируют по образованию характерных цитоплазматических включений и в реакции прямой ИФ с противохламидийными флюоресцирующими сыворотками.

M.pneumoniae растет на специальных питательных средах сложного состава с добавлением сыворотки или асцитической жидкости и образует микроскопические колонии (рис. 14.1.2), выделить ее в чистой культуре удается не ранее чем через месяц после посева. Идентифицируют чистую культуру по биохимическим и антигенным свойствам.

Биопроба. Для получения чистых культур риккетсии и хла-

мидий также применяют биопробы (заражение морских свинок и мышей соответственно).

Экспресс методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. Антигены возбудителей можно обнаружить в материале от больного с помощью серологических реакций (РСК и др.).

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика атипичных пневмоний. Одним из ведущих методов диагностики атипичных пневмоний является серодиагностика. Используют метод парных сывороток.

Серодиагностика Ку-риккетсиоза. Начиная с 8-го дня болезни для выявления специфических антител ставят реакцию агглютинации или РСК со стандартными диагностикумами из C.burnetii. Титр антител в РСК достигает 1:80—1:160 на 5—6-й неделе болезни. Реакция считается положительной при нарастании титра антител не менее чем в 2 раза (табл. 14.1.1). Для серодиагностики также используют РНГА, метод непрямой ИФ, ИФА, РИА. Наиболее информативным для ранней диагностики является выявление антител класса М на 1-й неделе болезни.

Таблица 14.1.1. Результаты РСК с тремя диагностикумами

Диагностикум Разведение сыворотки

1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640

Coxsiella burnetii +

Chlamydophila pneumonia — — — — — —

Mycoplasma pneumonia +++ +++ +++ +++ +++ +

Серодиагностика пневмоний, вызванных Chlamydophila spp. Для

подтверждения диагноза пневмонии, вызванной C.psittaci — пситтакоза (орнитоза), — ставят РСК со стандартным орнитоз-ным диагностикумом и сыворотками больного, взятыми первый раз на 7-й день заболевания, а второй — в конце 3-й недели. При отсутствии нарастания титра антител реакцию повторяют через 4 нед после начала заболевания. Диагностическое значение имеет нарастание титра антител не менее чем в 2 раза (см. табл. 14.1.1). Для ранней диагностики пневмонии, вызванной Cpneumoniae, применяют метод непрямой ИФ, позволяющий выявлять антитела класса М, что особенно важно для своевременной диагностики заболевания у новорожденных.

Серодиагностика пневмонии, вызванной M.pneumoniae. Анти-

тела в сыворотках больных обнаруживают в РСК со стандартным микоплазменным диагностикумом или в РНГА, в которой используют эритроциты барана с адсорбированным на них микоплазменным антигеном. Диагностическое значение имеет нарастание титра антител в 4 раза и более в парных сыворотках крови, взятых от больного на 7—8-й день и в конце 2-й недели болезни. Высокий титр антител, выявленный в этих реакциях при однократном исследовании, не является доказательством заболевания,' так как положительная реакция часто возникает после перенесения заболевания даже в форме бессимптомной инфекции. Комплементевязывающие антитела сохраняются после перенесения заболевания около 1,5 лет, а антитела, выявляемые в РНГА, несколько дольше. В лабораторных условиях РСК нередко ставят одновременно с риккетсиозным, орни-тозным и микоплазменным диагностикумами по следующей схеме (см. табл. 14.1.1).

Кожно-аллергическая проба. Для диагностики орнитоза ставят кожно-аллергическую пробу с аллергеном C.psittaci.

• Микробиологическая диагностика легионеллеза

Лабораторная диагностика легионеллеза проводится в случаях тяжелых пневмоний неясной этиологии.

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мокрота, промывные воды бронхов.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериологическая диагностика. Для выделения возбудителя используют селективные питательные среды сложного состава, содержащие дрожжевой экстракт и другие факторы роста, а также различные антибиотики для подавления роста сопутствующей микрофлоры. Легионеллы относятся к медленно растущим микроорганизмам. Микроколонии, видимые под микроскопом, появляются на 2-е сутки роста, макроскопические — через 3—5 сут. Колонии имеют правильную округлую форму, ровные края, блестящую поверхность и мелкие размеры (2—4 мм). У молодых колоний наблюдается характерный розовый или сине-зеленый ободок и опалесцирующий центр. Идентификация выделенной чистой культуры осуществляется по морфологии, тинкториальным, культуральным и биохимическим признакам до рода. Для видовой идентификации используют методы прямой ИФ, а также биохимические и молекулярно-биологические исследования: газожидкостную хроматографию, рестрикционный анализ, метод ДНК-зондов.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования.

♦ Материал из очага исследуют прямым ИФ методом, позволяющим выявить антигены возбудителя.

♦ Обнаружение растворимых антигенов легионелл. Антиге
ны возбудителя могут присутствовать не только в мате
риале из очага инфекции, но также в крови и моче и
выявляются с помощью чувствительных серологических
реакций (ИФА, РИА).

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика. Для определения антител используют метод непрямой ИФ с антигеном из легионелл. Диагностическое значение имеет титр антител 1:32 и более и нарастание его в 4 раза и более в динамике заболевания. Реже применяют другие серологические реакции (ИФА, РИГА, микроагглютинации и ДР-)-

• Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Диагностические сыворотки противопневмококковые типоспе-цифические I, II и III типов. Используют для типирования (установления серовара) стрептококков пневмонии.