Розділення білків сироватки крові на ДЕАЕ-целюлозі

ДЕАЕ-целюлоза завдяки функціональним групам – діетиламіноетильним залишкам [–СН₂–СН₂–N=(С₂Н₅)₂] – у водному розчині має властивості слабкого аніоніту:

 

Використовують для хроматографічного фракціонування кислих і нейтральних білків.

Білки сироватки крові можна фракціонувати з використанням градієнтної або ступінчастої елюції. Сорбцію білків на колонці виконують при рН 5,65. За такого значення рН білки сироватки крові можуть сорбуватися на слабких аніонітах.

Реактиви

1. НCl – 0,5 н. розчин.

2. NaОН – 0,5 н. розчин.

3. ДЕАЕ-целюлоза.

4. Натрій-ацетатний буфер – 0,02 М; 0,1 М і 0,5 М розчини, рН 5,65.

5. NaCl – 0,3 н. розчин, виготовлений на 0,02 М натрій-ацетатному буфері.

6. NaCl – 0,5 н. розчин, виготовлений на 0,5 М натрій-ацетатному буфері.

Підготовка сорбенту. Приблизно 10 г ДЕАЕ-целюлози обробляють і переводять у НО^–-форму (див. 3.2.2).

Після видалення дрібних і великих частинок (якщо ДЕАЕ-целюлозу використовують не відразу, то її заливають водою й зберігають при +4°С з додаванням слідових кількостей толуолу) ДЕАЕ-целюлозу суспендують двічі у надлишку 0,1 М натрій-ацетатного буферного розчину (рН 5,65), витримуючи кожного разу в буфері по 30 хв. Надлишок рідини видаляють декантацією. Після другого суспендування суміш вносять у колонку.

Підготовка та заповнення колонки див. у 3.2.1. Розмір колонки становить 1,5´20 см. Після завершення заповнення колонки іоніт ущільнюють або за допомогою поршня, або тиском повітря до отримання постійної висоти стовпця гелю. Тоді колонку урівноважують вихідним елюювальним буферним розчином (0,02 М натрій-ацетатним буфером, рН 5,65), пропускаючи його дуже повільно через колонку (за такого розміру колонки із швидкістю п’ять–шість крапель за 1 хв) доти, доки рН розчину, що виходить з колонки, не буде дорівнювати вихідному. Кількість розчину, яка необхідна для урівноваження, становить приблизно вісім загальних об’ємів колонки.

Підготовка та нанесення досліджуваного матеріалу. Отримання сироватки крові: 2–3 мл крові набирають у суху центрифужну пробірку і залишають на 30–60 хв. Тонкою скляною паличкою обережно обводять стінки пробірки для відділення від неї згустка, центрифугують і сироватку зливають у чисту пробірку. Для видалення солей її діалізують проти вихідного буферного розчину. Для цього сироватку розводять у два рази вихідним буферним розчином, поміщають у мішечок для діалізу і діалізують проти того ж буфера протягом не менше ніж 12 год (можна залишати на ніч). У віддіалізованому розчині визначають концентрацію білка і наносять на колонку 50–100 мг білка об’ємом 1–3 мл.

Елюювання білка. Швидкість протікання розчинів через колонку не повинна перевищувати 15–20 мл/год. Елюат збирають порціями по 3 мл. Елюювання білків з колонки проводять буферними розчинами з лінійним градієнтом NaCl, змінюючи концентрацію останнього від 0 до 0,3 М (пристрій для створення лінійного градієнта див. на рис. 3.33, а). У змішувач поміщають 250 мл 0,02 М натрій-ацетатного буфера (рН 5,65), а в резервуар (ємність 1) – 250 мл того ж розчину, але з додаванням 0,3 М NaCl. Найміцніше адсорбовані білки додатково елюють 0,5 М розчином NaCl в 0,5 М ацетатному буфері (рН 5,65).

Буферний розчин, який витікає з колонки, збирають у пробірки порціями по 1–3 мл. Реєстрацію об’єму елюату, який пройшов через колонку, починають з моменту внесення зразка на колонку. Вміст білка у фракціях визначають спектрофотомертично при 280 нм. Оптичну густину розчинів, які містять рибонуклеазу, визначають при 230 нм, блакитний декстран – при 650 нм, цитохром с – при 412 нм. Після закінчення аналізу колонку промивають кількома об’ємами буферного розчину. Колонку промивають вихідним буферним розчином доти, доки оптична густина розчину на виході не досягне приблизно 0,05 при 280 нм. Будують профіль елюції окремих білкових фракцій. Для цього будують графік, на горизонтальній осі якого відкладають номери пробірок (фракцій) або об’єм рідини, яка пройшла через колонку, а на вертикальній – оптичну густину фракцій (див. рис. 3.16). Розраховують відсотковий вміст білка в окремих фракціях. Для ідентифікації білків, проелюйованих з колонки, вміст пробірок, які відповідають окремим пікам на кривій елюції, об’єднують, піддають діалізу, ліофілізують і досліджують за допомогою електрофорезу на папері або в поліакриламідному гелі.

Таблиця

№	Буферний розчин	Полярність розчину	Кількість, мл
1.	Натрій-фосфатний буферний розчин	0,01 М
2.	Натрій-фосфатний буферний розчин	0,06 М
3.	Натрій-фосфатний буферний розчин	0,08 М
4.	Натрій-фосфатний буферний розчин	0,15 М
5.	Натрій-фосфатний буферний розчин	0,30 М
6.	Калій-фосфатний буферний розчин	0,70 М

 

 

У разі хроматографії сироваткового альбуміну застосовують буферні розчини з рН 6,8 у зазначених кількостях.

Таблиця

№	Буферний розчин	Полярність розчину	Кількість, мл
1.	Натрій-фосфатний буферний розчин	0,02 М
2.	Натрій-фосфатний буферний розчин	0,07 М
3.	Натрій-фосфатний буферний розчин	0,11 М
4.	Натрій-фосфатний буферний розчин	0,40 М

 

 

Для інших білків використовують лінійний градієнт буфера 0,1–0,25 М по 75 мл.

Елюат, який витікає з колонки, збирають порціями по 3 мл. Вміст білка у фракціях визначають спектрофотометрично при 280 нм. Після закінчення аналізу колонку промивають кількома об’ємами буферного розчину. Будують профіль елюції окремих білкових фракцій. Для цього будують графік, на горизонтальній осі якого відкладають номери пробірок (фракцій) або об’єм рідини, яка пройшла через колонку, а на вертикальній – оптичну густину фракцій. Знаючи кількість білка, нанесеного на колонку, розраховують відносний вміст білка (у відсотках) в окремих фракціях.