Дослідження гетерогенності міоглобіну.методом диск-електрофорезу в поліакриамідному гелі

 

Диск-електрофорез.

Різними методами було встановлено, що міоглобіни виділені з м’язів різних тварин являються гетерогенними. для дослідження гетерогенності міоглобіну застосовують диск-електофорез в ПААГ та іоннообмінну хроматографію.

Дослідження гетерогенності взірців проводили методом диск-електофорезу в поліакриламідному гелі, описану Маурером. Цей метод являє собою об’єднаня методів розділення макромолекул по молекулярній масі і заряду та має високу розділяючу здатність.

З хімічною точки зору, поліакриламід який використовуються для електофорезу є сополімером двох мономерів: акриламіду і метиленбісакриламіду. Структура полімеру описується наступною формулою:

-СН₂-СН(СОNН)СН2-СН(СО-СН₂)-

-СН₂-СН(СОNН)СН2-СН(СО-СН₂)-

Гідрофільні властивості цього гелю викликані наявністю амідних груп, які повторюються через рівні інтервали.

Процес полімеризації акриламіду і метиленбісакриламіду починається в присутності тетраметилметилендіаміна (ТЕМЕД) та каталізатора персульфат амонію ((NH₄)₂SO₄).

Змінюючи концентрацію акриламіду і метиленбісакриламіду можна отримати гель з бажаючими розмірами пор.

При виборі концентрації акриламіду для отримання гелю враховують орієнтовану молекулярну масу фракціонованих речовин і форму їх молекул. Ми використовували гель 7.5%.

Обладнання: скляні трубочки, прилад для електрофорезу, джерело живлення.

Реактиви: Нами була вибрана наступна система для проведення диск-електрофореза:

1. Для приготування гелів:

Реактив А: 1 н НCl - 12 мл

ТРИС - 9.16 г

ТЕМЕД - 0.06 мл

Вода (б.дист.) - 25 мл

Реактив В: 1 н НCl - 12 мл

ТРИС - 1.495 г

ТЕМЕД - 0.115 мл

Вода (б/дист.) - 25 мл

 

Реактив С: метиленбісакриламід - 0.184 г

акриламід - 7 г

Вода (б. дист.) - 25 мл

Реактив D: метиленбісакриламід - 0.625 г

акриламід - 2.5 г

Вода (б. дист.) - 25 мл

Примітка: Акриламід та метиленбісакриламід розчиняти окремо (загальний об’єм зберігається).

Реактив Е: 0.004% рибофлавін (1 мг висушують на протязі доби під H₂SO₄ і розчиняють 25 мл бідистиляту).

Реактив F: 40% cахароза (40 г сахарози до 100 мл води б/д).

Персульфат амонію: 0.14% розчин (14 мг персульфату в 10 мл води б/д).

(Готують безпосередньо перед приготуванням гелю.)

2. Тріс-гліциновий буфер 0.05 М рН 8.3:

Тріс – 6 г + Гліцин – 28,8 г. + Вода бідист. – до 1 л.

Пред заповненням електрофоретичних камер буфер розвести в 10 разів.

3. Фіксуються: 5%-ним розчином ТХО або 7%-ним розчиним оцтової кислоти.

4. Фарбуються: 0,1% розчином Кумассі G-250 або амідочорним B-10.

Хід роботи:

Одержання дрібнопористого гелю:

Дрібнопористий гель готували в співвідношенні:

А:С: персульфат:Н₂О = 1:2:4:1

Приготовану суміш добре перемішували і заливали в скляні трубочки, які попередньо були запарафіновані з одного кінця. Висота стовбчика, утвореного сумішю в гелі, повинна складати 5-7 см. При внесенні в трубочку слідкувати, щоб не утворювались пухирці. Для створення рівної поверхні гелю зверху на суміш вносять за допомогою шприца декілька крапель бідистиляту. Нашаровувати обережно, щоб не відбувалося змішування із сумішю майбутнього гелю. Полімеризувати в термостаті при температурі 37°С.

Одержання крупнопористого гелю:

Крупнопористий гель готували в співвідношенні: 1

B:D:E:F = 1:2:1:4

В кожну трубочку на отриманий дрібнопористий гель нанести крупнопористий висотою по 0.2-0.4 мл приготованої суміші. Зверху так само нашаровують воду. Полімеризували дрібнопористий гель за допомогою ультрафіолету (на протязі @ 20 хвилин – доки не стане молочно-білим). Забрати фільтрувальним папером воду, перед нанесенням зразка.

Нанесення зразка: Концентрація зразка, що вводиться в трубочку, складає 100-150мкг. Для швидкого визначення концентрації білка можна використовувати спектрофотометричний метод, знаючи коефіцієнт екстинції. Зразок, що вноситься, змішують з 40% розчином сахарози. Об’єм зразка з сахарозою не повинен перевищувати об’єму концентруючого геля.

Електрофорез: Трубки виймають із штативу. знімають парафінове дно, поміщають в електродну камеру. При введені трубок у буфер нижньої електродної камери необхідно слідкувати за тим, щоб на кінцях трубок не було пухирців повітря.

Електрофорез проводити в тріс- гліциновому буфері рН 8,3 на протязі 20 хвилин при силі струму 2 мА на трубочку, а потім при силі струму на одну трубочку складає 4 мА. В якості індикатора використовують бромфеноловий синій, який додають по краплі у верхній буфер (в трубочки). Підключаються електоди так, щоб “ плюс” знаходився у нижній камері, а “мінус” – у верхній. В загальному електофорез протікає 1,5-2 години, доки мітка не почне виходити з трубочок.

Фіксування: По закінченню електрофореза гелі видаляються шприцем з тонкою голкою (з водою) і залежно від того чи будемо проводити визначення активності ферментів (1) чи білкових зон (2) занурююмо в розчини: в першому випадку – в рекційну суміш, а в другому - фіксуються 5%-ним розчином ТХО або 7%-ним розчиним оцтової кислоти на протязі 15-20 хвилин, потім відмиваються водою.

Фарбування: фарбуються на протязі 1 години 0,1% розчином Кумассі або амідочорного, надлишок фарби відмивають 7%-ним розчином оцтової кислоти.

Обробка результатів: Одержані результати деситометрують на денситометрі і проводять обробку електрофореграм чи проводили визначення коефіцієнту рухливості (Rf) для кожної з виявлених білкових зон за формулою:

 

Rf = S₁/S, де

 

S₁ – пробіг, який пройшла речовина, для якої визначається Rf,

S – загальний пробіг при електорофорезі (від старту до мітки)

(Приготування реактивів представлено окремо).

 

Хід роботи:

Метод має високу розділяючу здатність, оскільки, використовуючи його можна розділити білки як за молекулярною масою, так і за величиною заряду.

В якості каталізітора полімеризації акриламіду і метиленбісакриламіду використовують персульфат амонію, який може привести до окислення міоглобіну і до появи додаткових фракцій. В зв’язку з цим безпосередньо перед дослідом проводять “холостий” електрофорез для видалення персульфату амонію, а також інших низькомолекулярних речовин, що знаходяться в гелі.

Концентрація міоглобіна, що наноситься в трубочку, складає 100-150мкг. Для швидкого визначення концентрації білка можна використовувати спектрофотометричний метод, знаючи коефіцієнт екстинції.

Зразок, що вноситься, змішують з 40% розчином сахарози. Об’єм зразка з сахарозою не повинен перевищувати об’єму концентруючого геля.

Електофорез протікає 1,5-2 години, сила струму на одну трубочку складає 4 мА.

По закінченню електрофорезу гелі фіксуються 5%-ним розчином ТХО або 7%-ним розчином оцтової кислоти на протязі 15-20 хвилин, потім відмиваються водою, фарбуються на протязі 10 хв. 0,1% розчином Кумассі-G-250 або 5 хвилин амідочорним 10-В. Надлишок фарби відмивають 7%-ним розчином оцтової кислоти.

Оскільки міоглобін має пероксидазну активність, можна провести ідентифікацію тільки гемвмісних фракцій, Для цього трубочки гелю не потрібно фіксувати, а відразу після електрофореза поміщують в розчин, що містить 0,2 г бензидину і 0,5 мл оцтової кислоти (льодової) на 100 мл води. Безпосередньо перед застосуванням цього розчину додають 0,2 мл 30% Н₂О₂. Зони, що відповідають хромопротеїду, фарбуються в синій колір.

Одержані результати деситометрують на денситометрі і проводять обробку електрофореграм.

Гемоглобін

Виділення гемоглобіну.

Гемоглобін виділяли за методикою Драбкіна [18].

Обладнання та матеріали: цільна периферична кров, центрифуга, піпетки, центрифужні пробірки, скляні пробірки, штатив.

Реактиви: 1. Толуол,

2. Дистильована вода.

3. 0,150 М (0,9 %) NaCl.

 

Гемоглобін, отримують з еритроцитів гепаринізованої периферичної крові людини чи тварини. Еритроцити відділяють від плазми центрифугуванням протягом 10 хвилин при 3000 об/хв (500 g). Плазму відбирають піпеткою і використовують для подальших досліджень. Еритроцитарну масу відмивають від білків плазми крові охолодженим ізотонічним розчином NaCl (0,150 М). До еритроцитарної маси у пробірки додають 4 – 5 об’ємів охолодженого ізотонічного розчину, обережно перемішують і центрифугують 10 хвилин при 3000 об/хв. Процедуру повторюють 5 раз.

До промитих еритроцитів додавали дистильовану воду та толуол в співвідношенні 1:1,5:1. Суміш добре перемішували на протязі 15 хвилин, поміщали на декілька годин в холодильник для остаточного проходження гемолізу. Центрифугували протягом 15 хв при 8000 об/хв (3500 g). для відділення строми. Отриманий гемолізат обережно відбирали пастерівською піпеткою, або шприцом, фільтрували і використовували для подальших досліджень.