Встроили в плазмиду pBR 322, в среднюю часть гена пенициллиназы

(фермент ______в норме выделяется из клетки), которую транспортировали в

Бактерию. Сконструированная плазмида, как оказалось, содержала ин-

Формацию о структуре проинсулина, а не препроинсулина. При трансля-

Ции мРНК в клетках E. coli синтезировался гибридный белок, содержащий

Последовательности пенициллиназы и проинсулина. Гормон из этого бел-

Ка выщепляли трипсином. Было доказано, что полученный таким образом

Белок влияет на сахарный обмен аналогично гормону поджелудочной же-

Лезы. В 1979 г. в США в течение трех месяцев синтезировали гены, коди-

Рующие А- и В-цепи инсулина; гены были собраны из 18 и 11 олигонук-

Леотидов соответственно. Далее гены были встроены, как и при получении

соматостатина, в плазмиду в конце гена β-галактозидазы кишечной палочки.

В клетках E. coli также осуществлен синтез проинсулина, а не только

Его отдельных цепей. На выделенной матричной мРНК синтезировали

ДНК-копию. Синтез проинсулина имеет определенные преимущества, так

Как процедуры экстракции и очистки гормона минимальны.

Совершенствование техники получения генноинженерных штаммов-

Продуцентов с помощью различных приемов (амплификацией плазмид,

Инкапсулированием вводимых рекомбинантных ДНК, подавлением про-

Теолитической активности реципиентных клеток) позволило получить

высокие выходы гормона, до 200 мг/л культуры. Медико-биологические и

Клинические испытания генноинженерного белка показали пригодность

Препарата, и в 1982 г. он был допущен к производству во многих странах.

Pst

Ген устойчивости

К тетрациклину

Ген устойчивости

К тетрациклину

Ген

Пенициллиназы

Ген

Пенициллиназы

Пенициллиназа

Ген

Проинсулина

Проинсулин

Инсулин

Рис. 4.3. Биосинтез инсулина крысы в сконструированных клетках E. coli

(по Gilbert e.a., 1980).

а) карта плазмиды pBR322 c двумя генами – пенициллиназы и устойчивости к тетрациклину;

Б) карта, полученная при определении последовательности кДНК рекомбинантной плазмиды

В продуцирующем инсулин клоне E. coli; в) гибридный белок; г) биологически активный инсулин

После удаления пенициллиназы и сегмента проинсулина.

Биосинтез соматотропина

Соматотропин (гипофизарный гормон роста) впервые был выделен в

Г. из трупного материала. Выход гормона из одного гипофиза со-

ставлял около 4–6 мг в пересчете на готовый фармацевтический препарат.

Для лечения карликовости необходимая доза составляет 6 мг в неделю в

Течение года. Кроме недостатка по массе, получаемый экстракцией препа-

Рат был гетерогенным, против него вырабатывались антитела, которые

Сводили на нет действие гормона. Более того, существовала опасность,

Синтетические

Олигодезоксинуклеотиды

(12 фрагментов)

Гипофиз

Человека

Лигаза

Рекомбинантная

Плазмида

С геном ГРЧ

Экспрессирующий

Вектор

PBR322

Регуляторная область lac

Липкий конец Тупой конец

МРНК

Сверхразмерная кДНК ГРЧ

Обратная

Транскриптаза

Рестрикционная

Лигаза эндонуклеаза

Очистка и монтаж Очистка

Фрагмента

ATG ГРЧ 1-24 ГРЧ кДНК 25-191

Регуляторная область lac

PBR322

Рис. 4.4. Схема конструирования гена соматотропина комбинацией химического синтеза

И выделения природной мРНК (по P. Newmark, 1979).

Что при получении препарата могло произойти заражение организма мед-

Ленно развивающими вирусами. Поэтому дети, получавшие данный пре-

Парат, нуждались в многолетнем медицинском наблюдении.

Генноинженерный препарат имеет несомненные преимущества: досту-

Пен в больших количествах, гомогенен, не содержит вирусов. Синтез сома-

Тотропина, состоящего из 191 аминокислотного остатка, был осуществлен в

США Гедделем с сотрудниками в 1979 г. (компания «Генентек») (рис. 4.4).

При химико-ферментном синтезе ДНК получается ген, кодирующий

Предшественник соматотропина, поэтому был выбран специальный путь