Правила отримання матеріалу та виготовлення гістологічних препаратів

Гістологічними препаратами (мікропрепаратами) називаються виготовлені з тканин (органів) забарвлені зрізи, плівки, мазки, відбитки, окремі клітини, які помістили на предметне скло, залили тонким шаром прозорої речовини і покрили покривним склом. Основними етапами виготовлення гістологічного препарату є: отримання матеріалу, його фіксація, промивання, зневоднення, ущільнення, заливка, виготовлення і забарвлення зрізів.

Отримання матеріалу. Матеріал - шматочки тканини або органа - гострими ножицями або лезом вирізається так, щоб уникнути зайвого травмування. Об'єм шматочків - приблизно 0.5 - 2.0 см². Матеріал повинен бути свіжим, тобто брати його треба якнайшвидше після смерті людини або експериментальної тварини.

Фіксація матеріалу. Забраний шматочок занурюється у фіксуючу рідину - фіксатор. Об'єм фіксатора має перевищувати в 50 - 100 разів об'єм шматочка. Фіксатори бувають простими і складними. Найбільш поширеним є простий фіксатор - 10% розчин формаліну. Використовується також етиловий і метиловий спирти, розчини солей важких металів, оцтова, пікринова, осмієва кислоти та інші. Складні фіксатори - це суміші, що складаються з окремих компонентів у визначених співвідношеннях. Наприклад, рідина Ліллі (96°спирт, формалін, льодяна оцтова кислота), рідина Карнуа (абсолютний спирт, хлороформ, льодяна оцтова кислота) тощо.

Фіксацію можна проводити при кімнатній температурі, а в разі використання гістохімічних методів дослідження - при зниженій температурі. Термін фіксації залежить від властивостей фіксатора, розмірів об'єкта - від кількох хвилин до кількох діб.

Застосування різних фіксаторів обумовлене метою фіксації, тобто збереження прижиттєвого стану морфологічних структур тканини або органа на момент смерті організму з найменшими змінами внаслідок фіксації. Фіксація матеріалу полегшує в подальшому сприйняття об'єктами барвників і запобігає процесам гниття.

Промивання матеріалу. Після фіксації матеріал звичайно промивається проточною водою протягом 24- 48 годин для видалення фіксатора.

Зневоднення і ущільнення матеріалу. Мета цих етапів - видалення води з шматочків і підготовка їх до виготовлення тонких зрізів.

Зневоднення шматочків, які фіксувалися у водних розчинах, проводиться поступово в спиртах наростаючої концентрації: 50°, 60°, 70°, 80°, 100° (абсолютний спирт). Останній отримують з 96° спирту шляхом його зневоднення мідним купоросом або перегонкою через мармурову крошку. Термін перебування шматочків у спиртах різної концентрації залежить від об'єкта і його розмірів (від кількох годин до кількох діб).

Ущільнення матеріалу досягається просоченням шматочків рідкими середовищами, які можуть ставати твердими (парафін, целоїдин). Оскільки вказані речовини розчиняються в ксилолі, бензолі або толуолі, то шматочки спочатку занурюють у суміш спирту з ксилолом (1:1), потім у дві - три порції чистого ксилолу, далі - у суміш ксилолу з парафіном при 55°С - 56°С. Для заливки матеріалу і виготовлення блоків використовують металеві, паперові або керамічні формочки.

Виготовлення зрізів. З парафінових або інших блоків на спеціальному приладі - мікротомі, можна зробити тонкі (завтовшки 5-7 мкм) зрізи. Для цього користуються мікротомними ножами. Потім зрізи збирають і прикріплюють до предметного скла, попередньо змазаного сумішшю білка курячого яйця і гліцерину (1:1).

Зрізи для гістохімічного дослідження можна зробити на заморожуючому мікротомі або на мікротомі-кріостаті. Мікротом-кріостат - це фреонова холодильна установка, до камери якої вмонтовано мікротом. Робоча температура в камері (від 0°С до -20°С) підтримується автоматично. У кріостаті є можливість отримати тонкі зрізи з нефіксованої тканини.

Тонкі зрізи є прозорими і для того, щоб розрізнити деталі будови тканини або органа, їх треба забарвити.

Забарвлення зрізів. Існує багато методів забарвлення зрізів, для чого застосовується більше трьох тисяч барвників. Гістологічні барвники умовно можна розділити на загальні і спеціальні; за походженням - на рослинні, тваринні і синтетичні; за хімічними властивостями - на основні, кислі і нейтральні.

Загальні барвники використовуються для вивчення загальної морфології клітин, тканин і органів. До ядерних барвників належать гематоксилін, кармін, азур II, сафранін. Гематоксилін виготовляють з кори кампешевого дерева, яке росте у Південній Америці. Він забарвлює ядра у синьо-фіолетовий колір. Кармін - це екстракт яйценосних комах кошенілі, забарвлює ядра в ясно-червоний колір. Сафранін - у темно-червоний, азур II - у фіолетовий колір. Це основні катіонні барвники, які містять позитивно заряджені атоми азота. Гістологічні структури, що забарвлюються основними барвниками, називаються базофільними.

Цитоплазматичні барвники - еозин, еритрозин, кислий фуксин - забарвлюють цитоплазму у різні кольори, найчастіше в різні тони червоного кольору. За хімічними властивостями вони є кислими, або аніонними, за походженням - синтетичними. Структури, які здатні забарвлюватись кислими барвниками, називаються оксифільними (ацидофільними, еозинофільними).

Нейтральні барвники - це суміші барвників, що містять кислі і основні компоненти.

Спеціальні барвники вибірково забарвлюють певні речовини або структури. Наприклад: судан III забарвлює ліпіди в оранжевий колір, орсеїн - еластичні волокна в бурий колір тощо.

Виявити гістологічні структури можна також методом імпрегнації. Це метод обробки шматочків або зрізів розчинами солей важких металів з наступним їх відновленням.

Процедура забарвлення зрізів починається з їх депарафінізації, тобто обробки ксилолом або толуолом, подальшому проведенні через спирти все меншої концентрації. Далі, згідно прописів для кожного методу, зрізи обробляють у певній послідовності розчинами барвників. Після забарвлення зрізи зневоднюють у спиртах наростаючої концентрації і поміщають у прозоре середовище - канадський бальзам або полістирол, які мають показники заломлення, подібні до скла.

Гістологічні препарати, виготовлені з дотриманням вищезазначених вимог, можуть зберігатись дуже довго.

Правила користування мікроскопом

1. Мікроскоп переносять, тримаючи однією рукою за колонку, а другою - підтримуючи основу.

2. Мікроскоп розміщують на робочому місці так, щоб колонка була біля спостерігача, а дзеркало було спрямоване до джерела світла. Зошит для зарисовки слід покласти з правої сторони.

3. Перевірити револьвер мікроскопа, поставити об'єктив малого збільшення (8х) і за допомогою макрогвинта наблизити його нижній край на відстань 1 см від предметного столика.

4. Встановити освітлення, повертаючи дзеркало до такого положення, коли усе поле мікроскопа буде освітлене рівномірно і достатньо інтенсивно. Встановлення освітлення контролювати, дивлячись в окуляр лівим оком.

5. На предметний столик помістити мікропрепарат покривним склом догори. Зріз повинен знаходитись над отвором столика.

6. Обертаючи макрогвинт, знайти чітке зображення структур органа або тканини на зрізі, підібрати ділянку для вивчення, поставити її в центр поля зору мікроскопа. Після цього мікропрепарат можна закріпити клемами.

7. При необхідності переходу на велике збільшення треба: підняти тубус мікроскопа обертанням макрогвинта на себе, плавним рухом повернути револьвер і встановити об'єктив великого збільшення (40х), почувши при цьому клацання. Далі, дивлячись збоку на мікроскоп, обертати макрогвинт від себе, поки фронтальна лінза об'єктиву максимально наблизиться до покривного скла мікропрепарату. Після цього, дивлячись в окуляр, дуже повільно обертати макрогвинт на себе, поки не з'явиться більш-менш чітке зображення. Слід за цим перейти до повільного обертання мікрогвинта до появи чіткого зображення. Необхідно пам'ятати, що необережним рухом можна розчавити мікропрепарат.

8. У разі переходу до вивчення іншої ділянки мікропрепарата, слід повернутися до малого збільшення і повторити пп. 6 і 7.

9. Розглянути і вивчити препарат при великому збільшенні і приступити до його зарисовки.

10. Після закінчення роботи з мікроскопом встановлюють об'єктив малого збільшення.

ОБСЯГ САМОСТІЙНОЇ РОБОТИ НА ЗАНЯТТІ

Вивчіть і опишіть в альбомі електронні мікрофотографії:

1. Эукаріотична клітина (плазмоцит) (зб.14000) (рис. 1).

Позначення: 1-клітинна оболонка-плазмолема, 2-цитоплазма, 3-ядро, 4-міжклітинна речовина.

2. Щільно розташовані клітини печінки (гепатоцити) (зб.10000) (рис. 2)

Позначення: 1-ядро, 2-цитоплазма, 3-цитолема сусідніх клітин і вузький міжклітинний простір.

3. Клітина круглої форми (лімфоцит) (зб.10000) (рис. 3).

Позначення: 1-ядро, 2-цитоплазма, 3-цитолема.

4. Келихоподібна клітина (екзокриноцит) (зб.8000) (рис. 4).

Позначення: 1-ядро, 2-цитоплазма з секреторними гранулами, 3-цитолема, 4-базальний полюс, 5-апікальний полюс.

5. Клітина з відростками (нейроцит) (зб.8000) (рис. 5).

Позначення: 1-ядро, 2-цитоплазма, 3-цитолема, 4-відросток.

6. Циліндричні клітини (стовпчасті епітеліоцити) (зб.4000) (рис. 6).

Позначення:1-ядро, 2-цитоплазма, 3-цитолема, 4-ворсинки на апікальному полюсі.

7. Без'ядерні клітини (еритроцити) (зб.5000) (рис. 7).

Позначення: 1-плазмолема, 2-гемоглобін.

8. Без'ядерні структури (тромбоцити) (зб.5000) (рис. 8).

Позначення: 1-плазмолема, 2-цитоплазма.

9. Міжклітинна речовина (пухка волокниста сполучна тканина) (зб.9000) (рис. 10).

Позначення: 1-клітина (фібробласт), 2-міжклітинна речовина: а) волокнисті структури, б) аморфний компонент.

ЛІТЕРАТУРА

1. Луцик О.Д., Іванова А.Й., Кабак К.С., Чайковський Ю.Б. Гістологія людини. Підручник. Київ „Книга-плюс”, 2003. – 592 с.

2. Луцик О.Д., Іванова А.Й., Кабак К.С., Чайковський Ю.Б. Гістологія людини. Підручник. Київ „Книга-плюс”, 2010. – 582 с.

3. Волков К.С., Пасєчко Н.В. Ультраструктура клітин і тканин (навчальний посібник-атлас). - Тернополь: Укрмедкнига, 2004.-96 с.

4. Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б. Практикум з гістології, цитології та ембріолoгії. Навчальний посібник. Київ-Івано-Франківськ, 2000.

5. Чайковський Ю.Б., Сокуренко Л.М. Гістологія, цитологія та ембріологія (Атлас для самостійної роботи студентів). Навчальний посібник. Луцьк: Волинська обласна друкарня, 2006.

6. Збірник тестових завдань з гістології, цитології та ембріології / Ред. Дєльцова О.І., Геращенко С.Б., Мотуляк А.П., Попадинець О.Г., Волошинович В.М., Грищук М.І., Кулинич Г.Б., Бойко О.В., Лучків Н.Ю. – Івано-Франківськ: ІМСТА, 2011.

7. Конспект лекцій з гістології та ембріології.

* Тут і далі нумерація рисунків приведена відповідно до посібника-атласу Волков К.С., Пасечко Н.В. Ультраструктура клітин і тканин (навчальний посібник-атлас).-Тернополь: Укрмедкнига, 2004.-96 с.

 

ЗАНЯТТЯ 2