Биосинтез нуклеиновых кислот

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД.

МЕХАНИЗМЫ ТРАНСЛЯЦИИ.

 

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД - это зашифровка последовательности аминокислот путем последовательности чередования нуклеотидов.

Доказательство прямого соответствия между генами и белками и раскрытие химической природы генов выдвинули на первый план вопрос о том, каким образом последовательность нуклеотидов в ДНК может программировать последовательность аминокислот в полипетидной цепи.

Поскольку и генная ДНК, и белки состоят из линейных, неразветвленных цепей, следовательно предположили, а затем и доказали, что трансляция - это последовательный процесс, в ходе которого строящийся белок наращивается по одной аминокислоте в порядке, соответствующем порядку расположения нуклеотидных оснований в гене.

 

СВОЙСТВА ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОДА:

 

* триплетность,

* вырожденость,

* универсальность,

* последовательность,

* неперекрываемость,

* коллинеарность.

 

ТРИПЛЕТНОСТЬ.

 

Поскольку в состав белка входит 20 различных аминокислот, а в состав нуклеиновой кислоты - только 4 разных нуклеотида (А, Г, Ц, Т), последовательность нуклеотидов однозначно определяющая каждую аминокислоту, должна содержать не менее 3-х оснований, т.к. если 2 триплета кодируют 1 аминокислоту 42=16, если 43=64, если 44=256.

Сошлись на трех нуклеотидах, назвали группу из них, определяющую положение 1 аминокислоты - триплет или кодон. Долгое время эту гипотезу не удавалось проверить, первые данные подтверждающие это были опубликованы в 1961 г Криком. Он произвел тонкий генетический анализ сегмента в одном из генов фага Т4. Взаимодействие красителя акридина с ДНК бактериофага приводит к структурным изменениям в различных участках молекулы ДНК; каждое из этих изменений таково, что в ходе репликации и транскрипции все происходит так, как будто в цепь включено одно лишнее основание "вставка" или, наоборот, одно основание удалено из цепи "делеция". При многократной обработке акридитом можно получить много таких вставок (+) или "делеций" (-) по одной или по нескольку в различных сочетаниях.

 

ДИКИЙ ТИП

 

АЦТ. АЦ[Т]. АЦТ. АЦТ. АЦТ. АЦТ. АЦТ. АЦТ. и т.д.

(-)

 

акридин (делеция) 1-ая

 

МУТАНТНЫЙ ТИП

 

АЦТ. АЦА. Ц[Т]А. ЦТА. ЦТА. ЦТА. ЦТА. ЦТА. и т.д.

(-)

 

акридин (делеция) 2-ая

 

МУТАНТНЫЙ ТИП

 

АЦТ. АЦА. ЦАЦ. [Т]АЦ. ТАЦ. ТАЦ. ТАЦ. ТАЦ. и т.д. (-)

(-)

 

акридин (делеция) 3-ая

 

ДИКИЙ ТИП

 

АЦТ. АЦА. ЦАЦ. АЦТ. АЦТ. АЦТ. АЦТ. АЦТ. АЦТ.

 

 

измененная последовательность То же самое происходит и при вставках - при одной или 2-х модификациях одного знака + или - фаг ведет себя как мутант, однако 3 вставки или 3 делеции, а также сочетание 1 вставки и одной делеции приводит к восстановлению свойств фага. Такой результат при 3 близкородственных вставках или делециях указывал на то, что код должен состоять из 3 букв, либо из числа кратного трем, т.к. еще не было известно какому числу нуклеотидрв соответствует одна вставка или одна делеция.

В 1964 г. Ниренберг и Ледер разработали простой метод, позволивший прямо доказать 3-х буквенную структуру кода. Метод состоит в фильтровании на нитроцеллюлозном диске смеси, состоящей из рибосом, синтетических олигонуклеотидов различной длины от 2до 5-10, они использовались в качестве мРНК и различных аминоацил-т-РНК, каждая из которых несет свою аминокислоту (20 аминокислот - соответствует 20 различным тРНК). Комплекс олигонуклеотид-рибосома-аминоацил-тРНК задерживается на фильтре, а свободно? проходят через него. С помощью олигонуклеотидов, содержащих различное число остатков уридиловой кислоты У-У - ди,У-У-У - три, У-У-У-У -тетра, У-У-У-У-У -пента, было покозано, что связывается только фен-тРНК и происходит это только в том случае, если олиго-У содержит не менее трех оснований. Ниренберг и его сотрудники синтезировали все 64 возможных триплета и с помощью описанного метода не только подтвердии 3-х буквенную структуру кода для всех аминокислот, но и определили состав различных триплетов, соответствующих каждой аминокислоте.

Корниа и сотрудники (1964) готовили искусственно полирибонуклеотиды и, используя их как матрицу, синтезировали полипептидную цепь, где потом устанавливали количество и качество аминокислот.

 

ЛИЗ ГЛУ

ААГААГААГ.............

АРГ

В зависимости с чего начинали считывание получали гомопептид полиЛИЗ, ГЛУ или АРГ.

 

Если брали матрицы из 2-х нуклеотидов

ЦУЦУЦУЦУЦУЦУЦУЦУЦУЦУ и т.д.

если бы из 4-х - гомопептид, то получалась цепь, состоящая из 2-х аминокислот

 

ВЫРОЖДЕННОСТЬ.

 

На 20 различных аминокислот, участвующих в образовании белков, приходится 64 возможных кодона. Означает ли это, что несколько кодонов могут определять одну и ту же аминокислоту, т.е. является ли код вырожденным? После тех опытов, которые уже описаны получено множество подтверждений вырожденности кода. Из 64 триплетов 61 кодируют аминокислоты и только 3 остальных выполняют функцию сигнала о конце считывания информации. Различные аминокислоты кодируются различным количеством триплетов - метионин-1, лейцин-6, большинство от 2 до 4. Вырожденность имеет большое биологическое значение, позволяя противостоять губительному действию мутаций. В самом деле, если бы код не был вырожденным (20 аминокислот - 20 смысловых триплетов и 41 - бессмысловой), то в 2 случаях из 3-х изменение одного основания неизбежно приводило бы к остановке синтеза пептидной цепи, в случае вырожденности кода модификация одного основания в большинстве ведет к замене 1 аминокислоты на другую и синтез пептида продолжается.

Наконец, если все-таки заменилась аминокислота, она может быть взаимозаменяемой или же не входить в активный центр белка, т.е. не теряется биологическая активность данного белка.Большинство синонимов (триплеты, кодирующие одну аминокислоту) отличаются по последнему нуклеотиду.

 

УНИВЕРСАЛЬНОСТЬ КОДА.

 

Если любой триплет кодирует одну и ту же аминокислоту у всех живых существ, то код является универсальным. Вопрос разрешен практически: полиУ одинаково стимулирует включение включение ФЕН in vitro в присутствии рибосом и F ка бактериального так и животного происхождения (полиЦ - ПРО, полиА - ЛИЗ).

Ф??, Эренштейн и Лимпри синтезировали Нb in vitro, используя рибосомы и м-РНК кролика и тРНК и аминоацил-тРНК-синтазы из E.coli - продукт (Hb) идентичен был кроличьему. Это все подтверждает общее происхождение генетического кода живых систем, происходящих из одной и той же клеточной системы. 3,1млрд. лет Возникновение жизни из живой материи клетка многок2млн.лет

леточные организмы Homo sapiens.

 

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ КОДА. Считывание происходит со строго определенной точки (сдвиг

 

ТРАНСЛЯЦИЯ

(синтез белка)

 

I э. - подготовительный - иннициация и образование аминоацил-тРНК.

II э. - собственно трансляция.

III э.- пострибосомная трансформация.

 

I этап - на первой стадии белкового синтеза 20 аминокислот активируются путем присоединения через сложноэфирную связь к тРНК, этот процесс катализирует специфический по отношению к каждой аминокислоте и каждой тРНК аминоацил-тРНК-синтазой поэтому настолько специфично различают природные аминокислоты?, что возможность ошибки в условиях внутри клетки много меньше 1 на 104 (10 тыс.) это очень важно, т.к. в дальнейшем аминоацил-тРНК распознается не по аминокислоте, а по кодону.

Дальнейшие процессы протекают уже в рибосомах. У бактерий структура рибосом исследована подробно, константа седиментации 70 S, в определенных условиях диссоциирует на 2 субъединицы 50 S и 30 S, каждая из которых содержит 60-70%-РНК-компонентаи и до 50 различных белков(30-40%), некоторые белки выполняют каталитические функции, составной частью 50 S -субъединицы является пептидилтрансфераза, кроме этого выделяют 2 активных участка П(пептидильный) и А (аминоацильный).

После образования амиоацил-т-РНК и прихода мРНК из ядра в цитоплазму начинается иннициация путем образования иннициирующего комплекса из м-РНК, 30 S субъединицы рРНК и иннициирующей аминоацил-т-РНК, несущей на себе N-формилметионин (сейчас доказано, что у большинства бактерий синтез почти всех белков начинается с аминокислоты метионина, недаром следовательно предусмотрено, что МЕТ кодируется 1 триплетом) и следоватедьно все матричные РНК начинаются с кодона, кодирующего МЕТ).

Этот комплекс присоединяет к себе при участии нескольких белковых факторов иннициации (F) и ГТФ субъединицы 50 S и рибосома готова ко второму этапу.

 

II. Собственно трансляция

 

 

а) присоединение в аминоацильном участке аминоацил-т-РНК (кодон-антикодон -Н2-связь методом проб и ошибок)

б) образование пептидной связи (пептидилтрансферазная реакция), в П участке - не нагруженная т-РНК, в А - т-РНК с дипептидом

в) изменение конформации рибосом, за счет гидролиза ГТФ - транслокация.

 

И все повторяется сначала до тех пор пока в А один из бессмысленных терминирующих кодонов - это сигнал об окончании считывания м-РНК - терминация полипептидной цепи - происходит разделение компонентов на исходный состав, участвуют белковые факторы терминации R.

Обычно 1 мРНК транслирует несколько рибосом (полирибосом)

 

III этап - пострибосомные трансформации

 

После снятия с рибосом полипетидная цепь подвергаетсянекоторым изменениям (пострибосомные или посттрансляционные модификации):

а) фрагментация (часто при этом биологическая активность образуется?)

б) фосфорилирование (иногда свойства меняются) в) гидроксилирование (ПРО

 

ОБМЕН НУКЛЕОТИДОВ.

МАТРИЧНЫЕ БИОСИНТЕЗЫ.

 

Переваривание начинается в желудке под влиянием H+ и большой концентрации солей - происходит распад на белковый и нуклеотидный компоненты. Протеины перевариваются как и все белки, нуклеиновые кислоты в кишечнике распадаются до нуклеотидов, полинуклеотидов, нуклеозидов - всасывание и использование в виде блоков (Ф-гидролазы и фосфатазы).

БИОСИНТЕЗ НУКЛЕОТИДОВ.

 

Для синтеза пуриновых оснований (А, Г) - испльзуются: (сложный процесс, по числу промежуточных соединений и сложности не уступает гликолизу)

Для синтеза пиримидиновых оснований (Ц, Т, У) используются:

Углеводы - риб-5-ф, дезокси-риб-5-ф. Поступают с пищей, Фн - всегда поступает с пищей. Пуриновые (А,Г) и пиримидиновые (Ц,Т,У) основания несут генетическую информацию, сахарные и фосфатные группы выполняют структурную роль.

Функция генов - кодирование синтезируемых в клетке белков. В норме поток информации в клетке идет: ДНК РНК белок.

Функция ДНК - хранение записи генетической информации для всех белков и РНК, регуляция биосинтеза компонентов клетки, обеспечение индивидуальности.

Функция РНК - перевод информации с языка нуклеотидов на язык аминокислот + обеспечение этого процесса.

 

КАТАБОЛИЗМ НУКЛЕОТИДОВ.

 

Распад в тканях под влиянием ДНК- и РНК-аз до нуклеотидов.

Пиримидиновые основания при полном катаболизме дают CO2 и NH3 (мочевину). Пуриновые основания - мочевую кислоту (в основном в печени).

 

ПОДАГРА характеризуется артритом и избытком мочевой кислоты в крови (гиперуринемия образуется насыщенный раствор, который выпадает в осадок. Воспалительные изменения суставов, а также сопровождающие это заболевание поражения почек обусловлены осаждением в тканях кристаллов мононатриевой соли мочевой кислоты. Со временем отложения уротата натрия превращаются в видимые простым глазом узлы, камни в мочевыводящих путях. Причины гиперуринемии - алиментарная, нарушение выведения (заболевания почек), злоупотребление алкоголем, отравление солями тяжелых металлов, гентические факторы (нарушение механизмов повторного использования пуринов, активизация синтеза пуринов).

БИОСИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ.

 

Передача генетической информации (постулат молекулярной биологии): ДНК РНК белок. Механизм удвоения ДНК - репликация (перед делением накапливаются нуклеотиды - строительные кирпичи). В гипотезе Уотсона и Крика (1953г, трехмерная структура ДНК) самым существенным, с точки зрения генетики, является постулат, согласно которому 2 цепи ДНК комплементарны, и репликация каждой цепи, в результате которой образуются комплементарные дочерние цепи, приводит к возникновению 2 дочерних двуцепочных молекул ДНК, идентичных родительской молекуле, причем в каждой из дочерних молекул содержится одна цепь родительской. Такая репликация получила название полуконсервативной. Однако в принципе возможны и ещё 2 механизма репликации:

Меселсон и Сталь 1957/8 гг. провели эксперименты по определению способа репликации:

а) выращивали E.coli на среде (несколько поколений), содержащей в качестве источника азота (NH4Cl) изотоп N15

 

РЕПЛИКАЦИЯ ДНК.

 

А.Корнберг (с 1955г - поиск фермента, синтезирующего ДНК) - ДНК-полимераза I, 500 мг чистого фермента получены из 100 кг E.coli. Условия работы фермента: все нуклеотиды, затравка ДНК, матричная ДНК. Катализ идет в напралении 5`- 3`, обладает также нуклеазной активностью. Синтез ДНК in vitro. Высокая репаративная активность.

1967 год ознаменовался открытием ДНК-лигазы - образование фосфоэфирной связи между 2 цепями. Фермент активен при наличии свободной OH-группы на 3`-конце одной цепи и фосфатной группы на 5`-конце другой, необходима затрата АТФ. Цепи ДНК, соединяемые ДНК-лигазой, должны быть двухцепочными.

В 1969 г. Лусия и Кэрнс выделили мутантную форму E.coli, где только 0,5-1% нормальной полимерной активной ДНК-п-I, размножение хорошее, но быстрая гибель при УФ-облучении (вывод - репарация ДНК нарушена в мутантной форме. Выделены ДНК-п-II, III.

Синтез новой ДНК осуществляется одновременным раскручиванием родительской ДНК. Участок ДНК при этом называется репликационной волной. Начинается в определенном месте, идет в обоих направлениях с примерно одинаковой скоростью.

Одна цепь (дочерняя) синтезируется непрерывно (ведущая), а вторая прерывисто в виде коротких фрагментов (отстающая цепь) Оказаки (до 1000 нуклеотидов), сшивают фрагменты ДНК-лигазой. Образуются несколько репликационных включений через 3-7 тыс. пар нуклеотидов.

Затравкой для синтеза ДНК служит РНК. Фермент РНК-полимераза (праймаза) синтезирует короткую цепь из 10 нуклеотидов РНК, для этого фермента не нужна затравка для синтеза полинуклеотида. Синтез ДНК можно ингибировать рифамицином (ингибитор биосинтеза РНК).

В процессе репликации участвует большое количество белков (не менее 15), которые участвуют в поиске начала репликации, сплетении, расплетении, стабилизации одноцепочных участков, инициировании работы РНК-полимеразы. Механизм репликации столь сложен, чтобы избежать ошибки, постоянно идут возвраты правильности включения нуклеотидов, редактированию (частота ошибок не более 1 на 109-1010 пар.

 

РЕПАРАЦИЯ ДНК.

 

Основания могут теряться, изменяться, разрывы внутрицепочные, поперечные сшивки (ионизирующая радиация, УФО, химические вещества). Многие повреждения можно исправить, так как есть двойная информация (2 спирали). Участвуют или ДНК-п-I или эндонкклеаза, ДНК-п-I и ДНК-лигаза. Пример: образование пиримидинового димера (тимидиновый) при действии на ДНК УФО. Сочетание Т-Т в одной цепи образует сшивку:

Золотистая ксеродерма - заболевание кожи у людей (чувствительность кожи к солнечному свету и УФО). Кожа становится сухой, дерма атрофируется, веки - рубцы, поражения роговицы, во многих местах - рак кожи (гибель до 30 лет). Причина - низкая активность эндонуклеазы, которая гидролизует остов ДНК вблизи пиримидиновых димеров.

 

ТРАНСКРИПЦИЯ.

 

Для этого процесса необходимы условия:

1. Матрица (предпочтительно 2-х цепочная ДНК).

2. Активированные предшественник(рибонуклеотидтрифосфаты).

3. Ионы металлов (Mg2+, Mn2+).

4. РНК-полимераза ММ ~500 кД, 4 субъединицы (голофермент)

a2, b, b`, d. Без d-субъединицы - минимальный фермент (кор-фермент). b` - участвует в связывании матрицы; b - участвует в связывании субстратов (нуклеотидов); d - выбор участка инициации.

 

Транскрипция начинается на определенных участках (обычно с первой цепи ДНК списывается информация) ДНК-промоторах.

1 этап - инициация (голофермент - поиск промотора).

2 этап - элонгация (функция кор-фермента).

3 этап - терминация.

 

Участвуют белки в стадиях инициации (белок F) и терминации (белок Р). РНК-п в отличие от ДНК-п не проверяет правильность новообразования РНК, отсюда надежность ниже, ошибки на 104-105 пар нуклеотидов.

Ферменты РНК-полимеразы I, II, III участвуют в образовании р-РНК, и-РНК, т-РНК; причем активные молекулы РНК образуются транскрипции (процессинг) путем расщепления и модификации новосинтезированных цепей РНК. Разграничивающие участки (спейсерные) вырезаются м-РНК - практически не изменяется (у прокариот). У эукариот м-РНК образуется из большого транскрипта и последующего сращивания (сплайсинга) фрагментов.

У онко-вирусов открыт фермент РНК-зав-ДНК-полимераза (обратная транскриптаза) - при активации идет синтез вирусной ДНК -->вирусные белки.