Тема 1. Гистологическая техника

Краткое содержание темы

Современные виды микроскопической техники. В настоящее время одним из наиболее современных видов микроскопической техники является конфокальная микроскопия. Она широко используется в клеточной биологии и позволяет изучить структуры клеток и их органоидов благодаря своему высокому разрешению и контрасту, например: цитоскелет, ядро, хромосомы, или даже локализацию в них отдельных генов. Записав в памяти компьютера серию оптических срезов, можно провести объемную реконструкцию объекта и получить его трехмерное изображение, не используя трудоемкую методику изготовления и фотографирования серийных гистологических срезов. Кроме того, конфокальная микроскопия позволяет исследовать динамические процессы, происходящие в живых клетках, например, движение ионов кальция и других веществ через клеточные мембраны.

Новыми перспективными направлениями являются методики FRAP (восстановление флуоресценции после фотовыжигания) и FRET (передача энергии посредством флуоресцентного резонанса). Данные методы применяются для исследования подвижности биоорганических молекул, а также для определения расстояния между молекулами разных типов, их окружения и взаимодействия.

Большинство современных конфокальных микроскопов построено на базе люминесцентного микроскопа. Следовательно, объекты исследования должны быть предварительно окрашены соответствующим люминесцентным красителем или обладать собственной флуоресценцией. Конфокальный микроскоп предназначен прежде всего для усиления контраста изображения; принцип его работы основан на использовании лазерного осветителя, высокочувствительного фотоприемника и компьютерной обработки изображения. Разрешающая способность конфокального микроскопа - его важнейший параметр. Это минимальное расстояние между двумя точками,

при котором прибор может различать их как отдельные структуры. Теоретически разрешающая способность конфокального микроскопа в 1,4 раза выше обычного. Она зависит прежде всего от длины волны излучения, поэтому существует предел, накладываемый волновыми свойствами света. Поскольку конфокальный микроскоп - прибор оптико-электронный, то его разрешающая способность зависит не только от оптических узлов, но и от электронных систем преобразования оптического сигнала в электрический, а затем в цифровой. Конфокальный микроскоп позволяет рассмотреть структуры размером от 1-2 мкм до 0,2 мкм. Для изучения более мелких объектов придется применять другие методы, например, электронную микроскопию.

Поляризационная микроскопия используется в цитологии для определенных целей. Она позволяет выявить структуры с упорядоченным расположением молекул (например, кристаллы или фибриллярные белки). Такие структуры обладают, как известно, двойным лучепреломлением (анизотропией): проходящий через них световой луч разделяется на два, распространяющихся с различной скоростью и в различных направлениях. В поле зрения поляризационного микроскопа анизотропные объекты оказываются ярко светящимися на темном поле. Отечественный микроскоп МИН-8 является отличным прибором и вполне удовлетворяет исследователей-биологов. На кафедре имеется микроскоп «Варшава». Интерференционная микроскопия тоже основана на применении поляризационного света. На основе эффекта фазового сдвига можно судить о структурах объекта и плотности отдельных участков: т.к. сдвиг связан с плотностью структуры, то, измерив величину клетки (или ее части), можно найти ее сухой вес в граммах.

Флуоресцентнаямикроскопия позволяет изучать как собственную (первичную) флуоресценцию ряда веществ, так и вторичную флуоресценцию, вызывая ее окрашиванием биологических структур специальными красителями - флуорохромами. Принцип метода состоит в том, что некоторые вещества при световом облучении сами начинают светиться, причем длина волны испускаемого ими света всегда больше, чем длина волны света, возбуждающего флуоресценцию. Поэтому для возбуждения флуоресценции в видимой части спектра обычно пользуются синими или ультрафиолетовыми лучами. Собственной флуоресценцией обладают нуклеиновые кислоты, рибофлавин и ряд др. В качестве флуорохрома чаще всего применяют акридиновый оранжевый. Флуоресценцию можно наблюдать визуально и фотографировать. Всеми необходимыми качествами для произведения флуоресцентной микроскопии обладает наш отечественный микроскоп МЛ-2.

Электронная микроскопия. Создание электронного микроскопа основано на возможности магнитного поля, обладающего магнитной симметрией подобно линзам, фокусировать поток электронов (Буш, 1926). В связи с тем, что длина волны электромагнитного колебания при движении электронов (=0,0056) короче длины волны видимого света (200-800 нм), разрешающая сила электронного микроскопа во много раз больше, чем у световых микроскопов. Полностью реализовать возможности электронного луча невозможно в связи с техническими затруднениями, однако уже сейчас разрешающая способность электронного микроскопа равна 1/2-1/4 нм. Отечественные электронные микроскопы ЭММА-10 К имеют разрешающую способность 0,5 нм, а ЭНМ-100 Л - 0,25 нм. Электронный микроскоп построен следующим образом: 1) источник электронов (по типу электронной пушки); 2) система электромагнитных конденсоров; 3) держатель образца (исследуемого объекта); 4) электронный объектив (система электромагнитов); 5) система электронных проекторов; 6) флуоресцентный экран для визуального наблюдения; 7) камера для фоторегистрации изображения. Вся система электронного микроскопа работает в глубоком вакууме. В отличие от светового микроскопа, в котором изображение определяется в связи с поглощением света, в электронном микроскопе флуоресценция экрана и воспроизведение деталей объекта зависят от степени рассеивания электронов при прохождении через изучаемый объект. Препараты для электронного микроскопа должны быть тонкими (0,5-2,0 нм). Готовятся они на специальном ультратоме. В частности на кафедре имеется УМВБ-2.

В последние годы широко используются иммуноцитохимические и гистохимические методы исследования, целью которых является изучение химического состава тканей и клеток при сохранении их структуры, а также установление локализации химических веществ в определенных компонентах тканей, типах клеток и клеточных структурах. Имеющиеся в арсенале современной науки гистохимические реакции охватывают методы для выявления белков и аминокислот, нуклеиновых кислот, липидов, биогенных аминов, неорганических веществ, ферментов и т.д.

Хронокарта

1. Организационная часть с мотивацией темы - 5 мин.

2. Программированный контроль - 10 мин.

3. Опрос-беседа - 35 мин.

4. Объяснение препаратов - 10 мин.

5. Перерыв - 15 мин.

6. Контроль за самостоятельной работой студентов. Помощь в работе с препаратами - 65 мин.

7. Подведение итогов. Проверка альбомов - 10 мин. Время лабораторного занятия: 3 часа.