Биохимические показатели биологических жидкостей человека 3 страница

Достаточно часто доменам присваивают отдельные названия, так как их присутствие непосредственно влияет на выполняемые белком биологической функции, к примеру, Ca2+-связывающий домен кальмодулина, гомеодомен, отвечающий за связывание с ДНК в различных факторах транскрипции. Разные домены в белке могут перемещаться друг относительно друга при взаимодействии с лигандом, что облегчает дальнейшее функционирование белка.

Аналоги естественных лигандов белков используют в медицине в качестве лекарственных средств. Широкое применение такие лекарства нашли в регуляции передачи возбуждения через синапсы. Нейромедиатор, выделяемый при прохождении импульса нервными окончаниями, должен высокоспецифично взаимодействовать с белками-рецепторами на постсинаптической мембране. Однако, модифицируя химическую структуру нейромедиатора, можно получить вещества, которые также связывались бы с рецептором, но при этом менялся физиологический эффект: уменьшался или усиливался. В фармакологии такие вещества называют "антагонисты" и "агонисты" соответственно.

Однако некоторые структурные аналоги ли-гандов рецепторных белков не являются ингибиторами, а вызывают такие же или более сильные физиологические эффекты, чем природные лиганды. Их более сильный и длительный эффект часто связан с тем, что модифицированные лиганды медленнее инактивируются и разрушаются в организме.

Некоторые яды, попадая в организм человека, прочно связываются с определёнными белками, ингибируют их и тем самым вызывают нарушения биологических функций. Например, нейротоксины кобры и крайта специфически взаимодействуют с холинергическими рецепторами постсинаптических мембран, блокируя их работу, и оказывают курареподобное действие. Сродство нейротоксинов к холинергическим рецепторам очень высоко между токсином рецептором образуется множество связей, что и приводит к их практически необратимому соединению.

Необходимо помнить, что между лекарствами и ядами часто существует прозрачная граница, и эффект их действия зависит от дозы вводимого вещества. Так, лекарства, назначаемые в дозах, больших чем терапевтические, могут действовать как яды, т.е. вызывать серьёзные нарушения обмена веществ и функций организма, а яды в микродозах часто используют как лекарственные препараты. Например, атропин, широко применяемый для снятия спазмов гладких мышц, в больших дозах вызывает возбуждение ЦНС, а в ещё больших дозах - сон, переходящий в кому. Известное гапотензивное средство клофелин при передозировке вызывает коллапс.

12.Четвертичная структура белков. Особенности строения и функционирования олигомерных белков на примере гемсодержащего белка - гемоглобина.

Четверичная структура (или субъединичная, доменная) —способ укладки в пространстве отдельных полипептидных цепей, обладающих одинаковой (или разной) первичной, вторичной или третичной структурой, и формирование единого в структурном и функциональном отношениях макромолекулярно-го образования. Многие функциональные белки состоят из нескольких полипептидных цепей, соединенных не главновалентными связями, а неко-валентными (аналогичными тем, которые обеспечивают стабильность третичной структуры). Каждая отдельно взятая полипептидная цепь, получившая название протомера, мономера или субъединицы, чаще всего не обладает биологической активностью. Эту способность белок приобретает при определенном способе пространственного объединения входящих в его состав протомеров, т.е. возникает новое качество, не свойственное мономерному белку. Образовавшуюся молекулу принято называть олигомером (или мультимером). Олигомерные белки чаще построены из четного числа протомеров (от 2 до 4, реже от 6 до 8) с одинаковыми или разными молекулярными массами – от нескольких тысяч до сотен тысяч. В частности, молекула гемоглобина состоит из двух одинаковых α- и двух β-полипептидных цепей, т.е. представляет собой тетрамер. Молекула гемоглобина содержит четыре полипептидные цепи, каждая из которых окружает группу гема – пигмента, придающего крови ее характерный красный цвет. Основной вклад во взаимодействие субъединиц вносят гидрофобные взаимодействия. И α, и β-цепи относятся к α-спиральному структурному классу, так как содержат исключительно α-спирали. Каждая цепь содержит восемь спиральных участков. Простетическая группа нековалентно связана с гидрофобной впадиной молекулы гемоглобина

13.Лабильность пространственной структуры белков и их денатурация. Факторы, вызывающие денатурацию.

Под лабильностью пространственной структуры белка понимают способность структуры белковой молекулы претерпевать конформационные изменения под действием различных физико-химических факторов.

Под денатурацией следует понимать нарушение общего плана уникальной структуры нативной молекулы белка, преимущественно ее третичной структуры, приводящее к потере характерных для нее свойств (растворимость, электрофоретическая подвижность, биологическая активность и т.д.) Внешние проявления денатурации сводятся к потере растворимости, особенно в изоэлектрической точке, повышению вязкости белковых растворов, увеличению количества свободных функциональных SH-групп и изменению характера рассеивания рентгеновских лучей. Наиболее характерным признаком денатурации является резкое снижение или полная потеря белком его биологической активности (каталитической, антигенной или гормональной). При непродолжительном действии и быстром удалении денатурирующих агентов возможна ренатурация белка с полным восстановлением исходной трехмерной структуры и нативных свойств его молекулы, включая биологическую активность. Таким образом, при денатурации белковая молекула полностью теряет биологические свойства, демонстрируя тем самым тесную связь между структурой и функцией.

14.Шапероны - класс белков, защищающий другие белки от денатурации в условиях клетки и облегчающий формирование их нативной конформации.

Шаперо́ны (англ. chaperones) — класс белков, главная функция которых состоит в восстановлении правильной третичной структуры повреждённых белков, а также образование и диссоциация белковых комплексов. Термин «молекулярный шаперон» впервые был использован в работе Ласкей и других при описании ядерного белка нуклеоплазмина, способного предотвращатьагрегирование белков-гистонов с ДНК при образовании нуклеосом. Шапероны есть во всех живых организмах, и механизм их действия, нековалентное присоединение к белкам и их «расплетение» с использованием энергии гидролиза АТФ также консервативен.

Многие шапероны являются белками теплового шока, то есть белками, экспрессия которых начинается в ответ на рост температуры или другие клеточные стрессы. Тепло сильно влияет на фолдинг белка, а некоторые шапероны участвуют в исправлении потенциального вреда, который возникает из-за неправильного сворачивания белков.

Другие шапероны участвуют в фолдинге только что созданных белков в тот момент, когда они «вытягиваются» из рибосомы. И хотя большинство только что синтезированных белков могут сворачиваться и при отсутствии шаперонов, некоторому меньшинству обязательно требуется их присутствие.

Другие типы шаперонов участвуют в транспортировке веществ сквозь мембраны, например в митохондриях иэндоплазматическом ретикулуме у эукариот.

Продолжают обнаруживаться новые функции шаперонов, например, участие в разрушении белка, деятельности бактериального адгезина и в реакциях на заболевания, связанные с агрегацией белков.

15.Многообразие белков. Глобулярные и фибриллярные белки, простые и сложные. Классификация белков по их биологическим функциям и по семействам: (сериновые протеазы, иммуноглобулины).

До настоящего времен нет единой и стройной классификации, учитывающей различные параметры белков. В основе имеющихся классификаций обычно лежит один признак. Так, белки можно классифицировать:

1. по форме молекул (глобулярные или фибриллярные);

2. по молекулярной массе (низкомолекулярные, высокомолекулярные и др.);

3. по химическому строению (наличие или отсутствие небелковой части);

4. по выполняемым функциям (транспортные, защитные, структурные белки и др.);

5. по локализации в клетке (ядерные, цитоплазматические, лизосомальные и др.);

6. по локализации в организме (белки крови, печени, сердца и др.);

7. по возможности адаптивно регулировать количество данных белков: белки, синтезирующиеся с постоянной скоростью (конститутивные), и белки, синтез которых может усиливаться при воздействии факторов среды (индуцибельные);

8. по продолжительности жизни в клетке (от очень быстро обновляющихся белков, с Т_1/2 менее 1 ч, до очень медленно обновляющихся белков, Т_1/2 которых исчисляют неделями и месяцами);

9. по схожим участкам первичной структуры и родственным функциям (семейства белков).

Одной из самых старых и распространенных классификаций белков является классификация по форме молекулы.

Она делит белки на 2 группы: глобулярные и фибриллярные. К глобулярным относят белки, соотношение продольной и поперечной осей которых не превышает 1:10, а чаще составляет 1:3 или 1:4, т.е. белковая молекула имеет форму эллипса. Большинство индивидуальных белков человека относят к глобулярным белкам. Они имеют компактную структуру и многие из них, за счёт удаления гидрофобных радикалов внутрь молекулы, хорошо растворимы в воде.

Фибриллярные белки имеют вытянутую, нитевидную структуру, в которой соотношение продольной и поперечной осей составляет более 1:10. К фибриллярным белкам относят коллагены, эластин, кератин, выполняющие в организме человека структурную функцию, а также миозин, участвующий в мышечном сокращении, и фибрин - белок свёртывающей системы крови.

По химическому строению белки делят на простые и сложные. Белки, содержащие в своём составе только полипептидные цепи, состоящие из аминокислотных остатков, называют простые белки. Примером простых белков могут служить основные белки хроматина - гистоны; в их составе содержится много аминокислотных остатков лизина и аргинина, радикалы которых имеют положительный заряд. Однако очень многие белки, кроме полипептидных цепей, содержат в своём составе небелковую часть, присоединённую к белку слабыми или ковалентными связями. Небелковая часть может быть представлена ионами металлов, какими-либо органическими молекулами с низкой или высокой молекулярной массой. Такие белки называют сложные белки. Прочно связанная с белком небелковая часть носит название простетической группы. Простетическая группа может быть представлена веществами разной природы. Например, белки, соединённые с гемом, носят название гемопротеины.

Белки, соединённые с остатком фосфорной кислоты, называют фосфопротеинами. Фосфорные остатки присоединяются сложноэфирной связью к гидроксильным группам серина, треонина или тирозина при участии ферментов, называемых протеинкиназами.

В состав белков часто входят углеводные остатки, придающие белкам дополнительную специфичность и часто уменьшающие скорость их ферментативного протеолиза. Такие белки носят название гликопротеинов. Многие белки крови, а также рецепторные белки клеточной поверхности относят к гликопротеинам.

Белки, функционирующие в комплексе с липидами, называют липопротеинами, а в комплексе с металлами - металлопротеинами.

Сложный белок, состоящий из белковой части (апопротеин) и небелковой части (простетическая группа), называют " холопротеин ".

В ходе эволюции в пределах одного биологического вида замены аминокислотных остатков могут приводить к возникновению разных белков, выполняющих родственные функции и имеющих гомологичные последовательности аминокислот. Такие белки, имеющие гомологичные участки полипептидной цепи, сходную конформацию и родственные функции, выделяют в семейства белков

К семейству родственных белков относят сериновые протеазы. Это семейство ферментов, которые используют уникально активированный остаток серина, расположенный в активном центре, для связывания и каталитического гидролиза пептидных связей в белковых субстратах. Мишени для сериновых протеаз - специфические пептидные связи в белках (часто в других сериновых протеазах). Д ля всех белков этого семейства характерно наличие в активном центре остатков Сер₁₉₅, Гис₅₇, Асп₁₀₂(эту нумерацию используют независимо от их точного расположения в первичной структуре определённых сериновых протеаз). Выявлена также высокая схожесть их пространственных структур, несмотря на то, что только в 40% положений они содержат идентичные аминокислоты. Каталитический участок сериновых протеаз расположен в расщелине между двумя доменами. Некоторые аминокислотные замены привели к изменению субстратной специфичности этих белков и к возникновению функционального многообразия внутри этого семейства. Так, пищеварительные сериновые протеазы участвуют в переваривании (гидролитическом расщеплении пептидных связей) денатурированных пищевых белков. К ним относят трипсин, химотрипсин, эластазу, но каждый из этих ферментов предпочитает разрывать пептидные связи, образованные определёнными аминокислотами. Ещё большей субстратной специфичностью обладают сериновые протеазы, участвующие в тщательно контролируемых физиологических процессах, таких как активация каскада белков свёртывания крови, фибринолиза, активация белков системы комплемента, образования белковых гормонов.

Иммуноглобулины, или антитела, - специфические белки, вырабатываемые В-лимфоцитами в ответ на попадание в организм чужеродных структур, называемых антигенами. В организме человека вырабатывается около 10⁷ клонов В-лимфоцитов, каждый из которых специализирован на выработке одного из 10⁷ видов иммуноглобулинов. Все иммуноглобулины характеризуются общим планом строения: состоят из четырёх полипептидных цепей: двух идентичных лёгких (L - от англ,light), содержащих около 220 аминокислотных остатков, и двух тяжёлых (Н - от англ. heavy), состоящих из 440 аминокислот каждая. Все 4 цепи соединены друг с другом множеством нековалентных и четырьмя дисульфидными связями. Лёгкие цепи состоят из 2 доменов: вариабельного (V_L), находящегося в N-концевой области полипептидной цепи, и константного (C_L), расположенного на С-конце. Каждый из доменов состоит из 2 слоев с β-складчатой структурой, где участки полипептидной цепи лежат антипараллельно. β-Слои связаны ковалентно дисульфидной связью примерно в середине домена. Т яжёлые цепи имеют 4 домена: один вариабельный (V_H), находящийся на N-конце, и три константных (С_Н1, С_Н2, С_H3). Домены тяжёлых цепей IgG имеют гомологичное строение с доменами лёгких цепей. Между двумя константными доменами тяжёлых цепей С_H1, и С_Н2 есть участок, содержащий большое количество остатков пролина, которые препятствуют формированию вторичной структуры и взаимодействию соседних Н-цепей на этом отрезке. Этот участок называют "шарнирной областью"; он придаёт молекуле гибкость. Между вариабельными доменами тяжёлых и лёгких цепей находятся два идентичных участка, связывающих два одинаковых специфических антигена; поэтому такие антитела часто называют " биваленты ". Основные функции антител - обнаружение и связывание чужеродных антигенов, находящихся в организме вне его клеток (в крови, лимфе, межклеточной жидкости, в слизистых секретах). Это происходит с помощью специфических антигенсвязывающих участков разных клонов иммуноглобулинов. Кроме, того, благодаря связыванию антигена с антителом облегчается процесс дальнейшего разрушения чужеродных веществ. Специфичность пути разрушения комплекса антиген-антитело зависит от класса антител, которых существует 5 типов: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM.

16.Иммуноглобулины, особенности строения, избирательность взаимодействия с антигеном. Многообразие антигенсвязывающих участков Н- и L-цепей. Классы иммуноглобулинов, особенности строения и функционирования

Иммуноглобулины М - первый класс антител, синтезирующийся в развивающихся В-лимфоцитах. Различают 2 формы иммуноглобулинов М: мономерная, мембранно-связанная форма и пентамерная, секретируемая В-лимфоцитами в кровь.

Мембранно-с вязанная форма иммуноглобулинов М. Созревающие В-лимфоциты синтезируют мономерные бивалентные молекулы IgM, по структуре похожие на рассматриваемые выше IgG, которые встраиваются в плазматическую мембрану клеток и играют роль первых антиген-распознающих рецепторов. Прикрепление IgM к мембране осуществляется с помощью гидрофобного участка, находящегося в С-концевой ("хвостовой") области тяжёлых цепей, содержащей 25 гидрофобных аминокислотных остатков. Взаимодействие антигена с рецептором на поверхности В-лимфоцита вызывает его размножение и образование целого клона лимфоцитов, происходящих из одной, стимулированной антигеном клетки. Этот клон В-лимфоцитов будет вырабатывать иммуноглобулины с одинаковыми антигенсвязывающими участками. Однако В-лимфоциты способны переключаться на выработку других классов антител.

Секреторная форма иммуноглобулинов М. Когда В-лимфоциты впервые встречаются в жидкостях организма с неизвестным ранее антигеном, они синтезируют и секретируют в кровь IgM, которые содержат пять мономерных субъединиц, связанных друг с другом дисульфидными связями и дополнительной полипептидной J-цепью (рис. 1-46).

В тяжёлых цепях их мономеров отсутствует гидрофобная "хвостовая" часть. Пентамерная молекула содержит 10 участков связывания с антигеном, что облегчает вероятность прикрепления Неизвестного ранее антигена к иммуноглобулину. Взаимодействие антигена с IgM изменяет его конформацию и индуцирует связывание его "хвостовой" области с первым компонентом системы комплемента. Если антиген расположен на поверхности микроорганизма, активирование системы комплемента вызывает нарушение целостности клеточной мембраны и гибель бактериальной клетки.

Иммуноглобулины G. В количественном отношении IgG доминируют в крови и составляют около 75% от общего количества этих белков. Строение IgG подробно описано выше. В крови IgG обнаруживают только в мономерной форме; он секретируется активированными В-лимфоцитами в больших количествах при вторичном иммунном ответе, когда антиген повторно попадает в организм. У человека обнаружено 4 подкласса IgG: IgGg₁, IgGg₂, IgGg₃, IgGg₄. Порядковый номер указывает на количественное содержание каждого подкласса в сыворотке (в наибольшем количестве содержится IgGg₁ а в наименьшем - gGg₄). Степень гомологии между этими подклассами очень высока (около 90-95%). IgG не только эффективно связывают и инактивируют чужеродные молекулы и клетки, попавшие в организм, но также облегчают их дальнейшее уничтожение. Конформационные изменения в "хвостовой" области IgG после его взаимодействия с антигеном приводят к связыванию и активации белков системы комплемента. Кроме того, С-концевая область IgG способна взаимодействовать со специфическими рецепторами макрофагов и нейтрофилов, что приводит к фагоцитозу комплексов антиген-антитело и разрушению их в фагосомах. IgG - единственный класс антител, способный проникать через плацентарный барьер и обеспечивать внутриутробную защиту плода от инфекций.

Иммуноглобулины А. Основной класс антител, присутствующий в секретах желёз организма (слюны, молока, пищеварительного сока, секретов дыхательных путей). В сыворотке крови его содержание не превышает 10-15% от общего количества иммуноглобулинов. Мономерная форма по строению напоминает IgG. Однако в секретах IgA находится в основном в форме димера, где мономеры соединены дополнительной пептидной цепью J. На базальной поверхности эпителиальных клеток димер IgA специфически взаимодействует с белками клеточной поверхности, называемыми секреторным компонентом. Образующийся комплекс посредством эндоцитоза поглощается внутрь клетки и перемещается к апикальной части. Здесь комплекс подвергается действию протеолитических ферментов, и свободный димер высвобождается во внеклеточное пространство. Образующийся при взаимодействии IgA с антигеном комплекс не взаимодействует с белками системы комплемента и фагоцитирующими клетками, но препятствует прикреплению антигенов к поверхности эпителиальных клеток и проникновению их в организм.

Иммуноглобулины Е. Содержание этого класса иммуноглобулинов в крови крайне мало. IgE - мономеры, но, в отличие от IgG, их тяжёлые цепи е содержат не 3, а 4 константных домена. После синтеза и секреции в кровь В-лимфоцитами IgE связываются своими С-концевыми участками с соответствующими рецепторами на поверхности тучных клеток и базофилов. В результате они становятся рецепторами антигенов на поверхности данных клеток. После присоединения антигена хотя бы к двум антигенсвязывающим участкам двух соседних IgE клетка получает сигнал к секреции биологически активных веществ (серотонина, гистамина), хранящихся в секреторных пузырьках. Выброс этих веществ в значительной мере ответственен за развитие воспалительной реакции, а также таких аллергических реакций, как бронхиальная астма, крапивница, сенная лихорадка. Увеличение количества IgE может предшествовать развитию аллергических реакций.

Иммуноглобулины D. IgD обнаружены в крови в очень малых количествах. Мономерные белки играют роль рецепторов В-лимфоцитов; других функций у IgD пока не выявлено.

17.Физико-химические свойства белков. Молекулярный вес, размеры и форма, растворимость, ионизация, гидратация

Индивидуальные белки различаются по своим физико-химическим свойствам: форме молекул, молекулярной массе, суммарному заряду молекулы, соотношению полярных и неполярных групп на поверхности нативной молекулы белка, растворимости белков, а также степени устойчивости к воздействию денатурирующих агентов.

Различия белков по молекулярной массе. Б елки - высокомолекулярные соединения, но могут сильно отличаться по молекулярной массе, которая колеблется от 6000 до 1 000 000 Да и выше. Молекулярная масса белка зависит от количества аминокислотных остатков в полипептидной цепи, а для олигомерных белков - и от количества входящих в него протомеров (или субъединиц).

Различия белков по форме молекул. П о форме молекул белки делят на глобулярные и фибриллярные. Глобулярные белки имеют более компактную структуру, их гидрофобные радикалы в большинстве своём спрятаны в гидрофобное ядро, и они значительно лучше растворимы в жидкостях организма, чем фибриллярные белки (исключение составляют мембранные белки).

Различия по р астворимости белков. Растворимость белков в воде зависит от формы, молекулярной массы, величины заряда, соотношения полярных и неполярных функциональных групп на поверхности белка. Кроме этого, растворимость белка определяется составом растворителя, т.е. наличием в растворе других растворённых веществ. Например, некоторые белки легче растворяются в слабом солевом растворе, чем в дистиллированной воде. С другой стороны, увеличение концентрации нейтральных солей может способствовать выпадению определённых белков в осадок. Денатурирующие агенты, присутствующие в растворе, также снижают растворимость белков.

Различия по гидратации. На поверхности большинства внутриклеточных белков преобладают полярные радикалы, однако соотношение полярных и неполярных групп отлично для разных индивидуальных белков. Так, протомеры олигомерных белков в области контактов друг с другом часто содержат гидрофобные радикалы. Поверхности белков, функционирующих в составе мембран или прикрепляющиеся к ним в процессе функционирования, также обогащены гидрофобными радикалами. Такие белки лучше растворимы в липидах, чем в воде.

Различия по ионизации. Белки имеют в своём составе радикалы лизина, аргинина, гистидина, глутаминовой и аспарагиновой кислот, содержащие функциональные группы, способные к ионизации (ионогенные группы). Кроме того, на N- и С-концах полипептидных цепей имеются α-амино- и α-карбоксильная группы, также способные к ионизации. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от соотношения ионизированных анионных радикалов Глу и Асп и катионных радикалов Лиз, Apг и Гис. Значение рН, при котором белок приобретает суммарный нулевой заряд, называют " изоэлектрическая точка " и обозначают как pI. В изоэлектрической точке количество положительно и отрицательно заряженных групп белка одинаково, т.е. белок находится в изоэлектрическом состоянии. Так как большинство белков в клетке имеет в своём составе больше анионогенных групп (-СОО^-), то изоэлектрическая точка этих белков лежит в слабокислой среде. Изоэлектрическая точка белков, в составе которых преобладают катионогенные группы, находится в щелочной среде. Наиболее яркий пример таких внутриклеточных белков, содержащих много аргинина и лизина, - гистоны, входящие в состав хроматина. Белки, имеющие суммарный положительный или отрицательный заряд, лучше растворимы, чем белки, находящиеся в изоэлектрической точке. Суммарный заряд увеличивает количество диполей воды, способных связываться с белковой молекулой, и препятствует контакту одноимённо заряженных молекул, в результате растворимость белков увеличивается. Заряженные белки могут двигаться в электрическом поле: анионные белки, имеющие отрицательный заряд, будут двигаться к положительно заряженному аноду (+), а катионные белки - к отрицательно заряженному катоду (-). Белки, находящиеся в изоэлектрическом состоянии, не перемещаются в электрическом поле.

18.Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография.

Высаливание. Метод выделения белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.