Лабораторно-практические работы

ФЕРМЕНТЫ

Практическое занятие № 9.

Задание к занятию № 9.

Тема: Ферменты.

Актуальность темы.

Врач должен знать, что такое ферменты, их роль в организме, механизмы влияния активаторов и ингибиторов ферментов, регуляцию по типу обратной связи, что обеспечивает адаптацию организма к изменяющимся условиям, а также различия ферментного состава органов и тканей, так как при различных заболеваниях (инфаркт миокарда, вирусный гепатит, рак предстательной железы и др.) происходит изменение активности органоспецифичных (маркерных) ферментов (аспартатаминотрансаминазы, аланинаминотрансаминазы, креатинкиназы, кислой фосфатазы, α-амилазы и др.). Определение уровня активности ферментов в сыворотке крови имеет важное значение в диагностике и в прогнозе заболеваний. Кроме того, необходимо знать о применении интактных и иммобилизованных ферментов в медицине в качестве лечебных препаратов, о роли ферментов в возникновении наследственных энзимопатий (фенилкетонурия, галактоземия и др.).

Учебные и воспитательные цели:

- Общая цель занятия: научить использовать знания о значении ферментов в диагностике, прогнозе заболеваний, о роли ферментов в возникновении энзимопатий, в качестве лечебных препаратов.

- Частные цели занятия: уметь выделять ферменты из биологического материала, определять общие свойства ферментов: специфичность, влияние температуры и рН среды на активность ферментов.

 

1. Входной контроль знаний

1.1. Тесты

1.2. Устный опрос

2. Основные вопросы темы.

2.1.Что такое ферменты и их роль в организме.

2.2. Номенклатура, классификация ферментов.

2.3. Значение ферментов в диагностике и прогнозе заболеваний. Ферменты – лечебные препараты. Энзимопатии.

2.4. Химическая природа и механизм действия ферментов.

2.5. Общие свойства ферментов: специфичность, влияние температуры, pH среды на активность ферментов.

 

Лабораторно-практические работы.

3.1.Выделить ферменты из биологического материала.

3.2.Выяснить влияние рН среды на активность фермента.

3.3.Выяснить влияние температуры на активность фермента.

3.4. Проверить специфичность выделенных ферментов.

 

Выходной контроль.

4.1. Тесты

4.2. Ситуационные задачи.

5. Литература.

5.1. Материалы лекций.

5.2. Николаев А.Я. Биологическая химия. М.: «Высшая школа», 1998, с.53-58, 70-73, 78, 81-83.

5.3.Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: «Медицина», 1990, с. 92-93, 95-97, 105-108, 112-115, 126-128, 131-132.

5.4.Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: «Медицина», 2004, с. 114-116, 118-120, 129-134, 139-143, 159-163, 165-168.

5.5. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. М.: М. Медицина, 1983, раб 24 (п. 1), 25.

2. Основные вопросы темы.

 

2.1.Что такое ферменты и их роль в организме.

Ферменты или энзимы (Е) - это специфические белки, содержащиеся во всех клетках организма человека и являющиеся биологическими катализаторами.

Ферменты являются посредниками между организмом и окружающей средой, обеспечивают адаптацию организма к изменяющимся условиям (авторегуляторы).

В онтогенезе отмечается разнообразие возрастных изменений индукции ферментов. Разные периоды индукции определяют необходимость синтеза тех или иных ферментов. Важнейшим фактором, меняющим метаболизм детского организма, служит изменение условий питания, в частности, характер вводимой пищи. Это положение относится не только к гидролитическим ферментам желудочно-кишечного тракта. От количества и состава пищи зависит активность и тканевых энзимов. Например, на рационе, содержащем много белка в пище, наблюдается увеличение активности ферментов, синтезирующих мочевину и превращение аминокислот.

 

2.2.Номенклатура, классификация ферментов.

Номенклатура.

1.Тривиальные названия ферментов (пепсин, трипсин, химотрипсин).

2.Название субстрата + суффикс –аза (липиды – липаза, сахароза – сахараза, мальтоза – мальтаза).

3. По типу катализируемой реакции (дегидрирование – дегидрогеназа, карбоксилирование – карбоксилаза).

Основой классификации ферментов служит тип катализируемой реакции. Согласно данной классификации ферменты делят на шесть классов:

1. Оксидоредуктазы ( катализируют окислительно-восстановительные реакции).

2. Трансферазы (катализируют реакции межмолекулярного переноса атомов, групп атомов, радикалов).

3. Гидролазы (катализируют расщепление внутримолекулярных связей органических молекул с участием воды).

4. Изомеразы (катализируют взаимопревращения оптических и геометрических изомеров).

5. Лиазы (катализируют разрыв связей С-О, С-С, С-N, а также обратимые реакции отщепления различных групп от субстратов негидролитическим путем).

6. Лигазы (катализируют синтез органических веществ из двух исходных молекул с использованием энергии распада АТФ).

Классы состоят из подклассов, подклассы из подподклассов.

 

2.3.Значение ферментов в диагностике и прогнозе заболеваний. Ферменты – лечебные препараты. Энзимопатии.

Для каждой ткани (органа) характерен определённый ферментный состав (маркерные ферменты). Для сердечной мышцы маркерными ферментами являются - аспартатаминотрансфераза (АсТ), креатинкиназа; для печени – аланинаминотрансфераза (АлТ); для предстательной железы – кислая фосфатаза (КФ); для поджелудочной железы – α-амилаза и т.д.

При заболеваниях, сопровождающихся некрозом, маркерные (органоспецифичные) ферменты из повреждённых клеток в большом количестве поступают в кровь, и уровень их активности увеличивается, возникает гиперферментемия. Определение уровня активности маркерных ферментов в сыворотке крови имеет клиническое значение в диагностике и прогнозе ряда заболеваний.

Так, при инфаркте миокарда увеличивается уровень активности АсТ, креатиназы; вирусном гепатите – АлТ; раке предстательной железы – кислой фосфатазы; при заболеваниях поджелудочной железы – α-амилазы и т.д.

Некоторые ферменты применяют в качестве лечебных препаратов:

· Пепсин – при нарушении синтеза и секреции пепсина в желудке;

· Трипсин, химотрипсин используются для лечения гнойных ран;

· Фибринолизин, стрептокиназа – для предотвращения тромбообразования при пересадке органов и других операциях;

· Гиалуронидаза обеспечивает рассасывание рубцов;

· Аспарагиназа применяется при лечении некоторых злокачественных образований и т.д.

При отсутствии или недостатке тех или иных ферментов, связанных с мутацией гена, ответственного за синтез белка – фермента, возникают наследственные энзимопатии.

При фенилпировиноградной олигофрении отсутствует фермент гидроксилаза, катализирующая превращение аминокислоты фенилаланина в тирозин. Это приводит к повышению уровня фенилаланина в крови и моче, кроме того, из фенилаланина образуется фенилпировиноградная кислота, что оказывает токсическое действие на центральную нервную систему, в результате чего развивается слабоумие.

При галактоземии отсутствует фермент галактозо-1-фосфат-уридилтрансфе-раза, катализирующий превращение галактоза-1-фосфат в глюкоза-1-фосфат. Это является причиной увеличения галактозы и галактоза-1-фосфат в крови, что сопровождается у детей грудного возраста рвотой, диареей, вздутием живота и т.д.

 

2.4. Химическая природа и механизм действия ферментов.

Ферменты по химической природе являются белками. Им присущи физико-химические свойства белков: высокая молекулярная масса, амфотерность, гидрофильность. Они обладают электрофоретической подвижностью, высокой специфичностью, подвергаются высаливанию и денатурации.

В организме каждая химическая реакция протекает на определенном энергетическом уровне, при определённой энергии активации. Ферменты снижают энергию активации путем увеличения числа активированных молекул, которые становятся реакционными на более низком энергетическом уровне.

Ферментативная реакция – это многостадийный процесс. На первой стадии происходит сближение и ориентация, а также устанавливается индуцированное комплементарное соответствие между ферментом и субстратом, в результате образуется фермент-субстратный комплекс (ЕS).

На второй стадии возникает напряжение и деформация субстрата, в результате чего происходит сдвиг электронной плотности, изменение степени поляризации, связи в молекуле субстрата деформируются и легко распадаются.

В процессе образования фермент-субстратного комплекса достигается переходное состояние, характеризующееся низкой энергией активации, в результате чего образуется новый продукт, а после его диссоциации фермент возвращается в исходное состояние.

 

2.5. Общие свойства ферментов: специфичность, влияние температуры, pH среды на активность ферментов.

На активность ферментов оказывают влияние температура, рН среды, ионная сила растворов.

Так как ферменты по химической природе являются белками, повышение температуры свыше 45-50˚С приводит к тепловой денатурации и ферменты инактивируются (исключение – миокиназа мышц, папаин).

Низкие температуры не разрушают ферменты, а только приостанавливают их действие. Оптимальная температура для проявления активности фермента равна 37-40˚С.

На активность ферментов оказывает влияние реакция среды. Значение рН среды, при котором фермент проявляет максимальную активность, называют оптимумом рН среды для действия данного фермента. РН-оптимум действия ферментов лежит в пределах физиологических значений 6,0-8,0. Исключения: пепсин, рН-оптимум которого равен 2,0; аргиназа – рН-оптимум равен 10,0.

Ферменты обладают специфичностью. Различают несколько видов специфичности:

1. Абсолютная специфичность – фермент взаимодействует только с одним субстратом. Например, уреаза ускоряет гидролиз мочевины, но не расщепляет тиомочевину.

2. Стереоспецифичность – фермент взаимодействует с определенным оптическим и геометрическим изомером.

3. Абсолютная групповая специфичность – ферменты специфичны в отношении характера связи, а также тех соединений, которые образуют эту связь. Например, α-амилаза расщепляет α-гликозидную связь в молекуле мальтозы, состоящей из двух молекул глюкозы, но не расщепляет молекулу сахарозы, состоящую из молекулы глюкозы и молекулы фруктозы.

4. Относительная групповая специфичность. В этом случае ферменты специфичны только в отношении связи, но безразличны к тем соединениям, которые образуют эту связь. Например, протеазы ускоряют гидролиз пептидных связей в различных белках, липазы ускоряют расщепление сложноэфирных связей в жирах.

Лабораторно-практические работы.

3.1.Выделить ферменты из биологического материала.

ПОЛУЧЕНИЕ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ АМИЛАЗЫ.

2-3 ложечки высушенной поджелудочной железы растирают в ступке с добавлением 25 мл дистил. воды. Полученная масса настаивается в течение 10-15 минут, затем фильтруется. Фильтрат используется как ферментативный раствор.

 

ПОЛУЧЕНИЕ САХАРАЗЫ ИЗ ДРОЖЖЕЙ.

2-3 ложечки сухих пекарских дрожжей растирают в течение 5-7 минут с постепенным добавлением 25 мл дистил. воды. Полученная масса фильтруется. Фильтрат используется как ферментативный раствор.

 

3.2.Выяснить влияние рН среды на активность фермента

МЕТОДИКА ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ВЛИЯНИЯ РН СРЕДЫ

НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ.

В три пронумерованные пробирки вносят по 2 мл фосфатного буфера с различным значением рН (5,59; 6,81; 8,04). Приготовление буферного раствора:

 

pН Na₂HPO₄ KH₂PO₄

----------------- --------------------- ----------------

5,59 0,5мл. 9,5мл

6,81 5,0мл. 5,0мл.

8,04 9,5мл. 0,5мл.

 

Затем в пробирки добавляют по 1мл 1% р-ра крахмала и по 0,5 мл разбавленного (1:10) р-ра слюны и ставят их в водяную баню при температуре 37^оС на 10 минут. Каждую минуту из 2-й пробирки берут каплю жидкости и смешивают с каплей р-ра йода на предметном стекле. Это повторяют до тех пор, пока проба из 2-й пробирки даст красно-бурое окрашивание. Через 1-2 минуты после этого во все пробирки добавляют по 2-3 капли раствора йода.