Гибридизация ДНК–ДНК и ДНК–РНК

Если нагреть раствор ДНК выше температуры 90°С или сдвинуть рН в резко щелочную или резко кислую стороны, то водородные связи между нитями ДНК разрушаются, двойная спираль расплетается. Происходит денатурация ДНК или, по-другому, плавление. Если удалить агрессивный фактор, то происходит ренатурация или отжиг. При отжиге нити ДНК "отыскивают" комплементарные участки друг у друга и, в конце концов, вновь сворачиваются в двойную спираль.

Если в одной "пробирке" провести плавление и отжиг смеси ДНК человека и мыши, то некоторые участки цепей ДНК мыши будет воссоединяться с комплементарными участками цепей ДНК человека с образованием гибридов. Число таких участков зависит от степени родства видов. Чем ближе виды между собой, тем больше участков комплементарности нитей ДНК. Это называется гибридизация ДНК-ДНК.

Если в растворе присутствует РНК, то можно осуществить гибридизацию ДНК-РНК. Это помогает установить близость определенных последовательностей ДНК с какой-либо РНК.

Гибридизация ДНК-ДНК и ДНК-РНК используется как эффективное средство в молекулярной генетике.

Например, на основе знания белковой последовательности можно искусственно синтезировать РНК. При гибридизации такой РНК с образцами ДНК вполне реально определить участок ДНК, ответственный за синтез исходного белка.

Транскрипция

Транскрипция (англ. transcription – переписывание), – это биосинтез РНК на матрице ДНК. Биосинтез РНК происходит в участке ДНК, который называется транскриптом, с одного края он ограничен промотором (начало), с другого – терминатором (конец).

 

Как в любом матричном биосинтезе в транскрипции выделяют 5 необходимых элементов:

· матрица – одна из цепей ДНК

· растущая цепь – РНК

· субстрат для синтеза – рибонуклеотиды (УТФ, ГТФ, ЦТФ, АТФ)

· источник энергии – УТФ, ГТФ, ЦТФ, АТФ

· ферменты – РНК-полимеразы.

Существует три основных типа РНК‑полимераз: для синтеза пре‑рРНК (РНК-полимераза I), для синтеза пре‑мРНК (РНК-полимераза II), для синтеза пре‑тРНК и 5S‑рРНК (РНК-полимераза III).

В составе РНК‑полимеразы E.coli выделяют четыре субъединицы: две a‑субъединицы, по одной b- и b’-субъединице. Имеется также дополнительный белковый s‑фактор Последний необходим только для связывания с промотором и не участвует в удлинении цепи РНК.

Строение РНК‑полимераз эукариот имеет много общего со структурой бактериального фермента: они имеют по две больших субъединицы и несколько малых субъединиц.

Стадии транкрипции

Инициация

Промотор содержит стартовый сигнал транкрипции ТАТА‑бокс – определенную последовательность нуклеотидов ДНК, присоединяющий инициирующий
ТАТА‑фактор. Этот ТАТА‑фактор обеспечивает присоединение РНК‑полимеразы к той нити ДНК, которая будет использоваться в качестве шаблона для транскрипции. Так как промотор ассиметричен, то он связывает РНК‑полимеразу только в одной ориентации, что определяет направление транскрипции от 5’‑конца к 3’‑концу (5’ ® 3’).

Другие факторы инициации раскручивают спираль ДНК перед РНК‑полимеразой.

После синтеза затравочного фрагмента РНК длиной 8‑10 рибонуклеотидов s‑фактор отрывается от фермента.

Элонгация

Белковые факторы элонгации обеспечивают продвижение РНК‑полимеразы вдоль ДНК и расплетание нитей ДНК на протяжении примерно 17 нуклеотидных пар. РНК‑полимераза продвигается со скоростью примерно 40‑50 нуклеотидов в секунду в направлении 5’ ® 3’. Используя одновременно в качестве субстрата и источника энергии АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ.

Терминация

РНК‑полимераза остановится, когда достигнет терминирующих кодонов. С помощью белкового фактора терминации, так называемого r‑фактора (греч. r - "ро"), от матрицы ДНК отделяются фермент и синтезированная молекула РНК, которая является первичным транскриптом, предшественником мРНК или тРНК или рРНК.

Процессинг РНК.

Снтезированные молекулы РНК являются и в дальнейшем претерпевают ряд изменений, которые называются процессингом. У эукариот процессингу подвергаются все виды пре‑РНК, у прокариот – только предшественники рРНК и тРНК.