Определение активности фермента

 

Активность ферментов определяют:

- по скорости убывания субстрата;

- по скорости образования продукта.

За единицу активности любого фермента принимают такое его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоль вещества в 1 минуту.

 

мкмоль

Удельная активность = -----------------------

мин ^. мг белка

 

 

Изоферменты

 

Это разновидности ферментов, катализирующие одну реакцию, но отличающиеся по своему составу и физико-химическим свойствам.

Изоферменты имеются у ферментов с четвертичной структурой. Изоферменты различаются по кинетическим параметрам (V_макс и К_м), тканевой локали-зации, электрофоретической подвижности, чувствительности к регуляторам и т.д.

В зависимости от возраста, физиологического состояния и других причин, в организме устанавливается определенное соотношение изоферментов, которому соответствует определенный уровень активности фермента в целом. Изменение их соотношения в отдельных тканях или органах является одним из способов регуляции метаболических процессов в организме.

Определение в сыворотке крови активности определенных изоферментов используется для диагностики.

 

Регуляция активности ферментов

 

Вещества, изменяющие активность ферментов, называются эффекторами или регуляторами. Эффекторы, снижающие активность ферментов, называются ингибиторами, повышающие активность – активаторами.

 

Механизмы изменения активности ферментов

 

1. Аллостерический. Регулятор действует на аллостерический центр.

Аллостерический центр – это участок фермента, пространственно не совпадающий с активным центром. Присоединение регулятора к аллостерическому центру приводит к изменению конформации фермента, а следовательно, и активного центра. Сродство фермента к субстрату при этом изменяется. Аллостерические регуляторы вызывают активацию или ингибирование фермента. Аллостерическими регуляторами являются метаболиты, макроэрги, коферменты, катионы металлов, цАМФ, субстраты.

2. Химическая или ковалентная модификация. Заключается в изменении химической структуры фермента путем присоединения или отщепления за счет ковалентных связей каких-либо химических групп в любом месте фермента. Химическое изменение фермента вызывает изменение конформации, а следовательно, активности. Химическая модификация может осуществляться путем:

- фосфорилирования - дефосфорилирования;

- метилирования - деметилирования;

- аденилирования – деаденилирования.

Частным случаем химической модификации является ограниченный протеолиз. Ограниченный протеолиз – это процесс отщепления какой-либо части фермента в виде олиго- или полипептида. В результате формируется активный центр.

4. Взаимодействие "белок-белок". Этот механизм регуляции характерен только для ферментов с четвертичной структурой, то есть состоящих из субъединиц. Диссоциация или ассоциация этих субъединиц приводит к изменению конформации активного центра. Для одних ферментов ассоциация приводит в активации фермента, а диссоциация – к ингибированию, для других - наоборот. Изменение взаимодействия между субъединицами возникает в результате присоединения аллостерического регулятора или в результате химической модифи-кации фермента.

 

Ингибирование

 

 

Ингибирование ферментов бывает обратимым и необратимым.

 

Необратимые ингибиторы прочно связываются с ферментами, при этом связываются или разрушаются функциональные группы, необходимые для проявления каталитической активности.

Необратимые ингибиторы не имеют физиологического значения и являются ферментными ядами.

Обратимые ингибиторы действуют недолго. Комплекс "фермент-ингибитор" непрочен и быстро диссоциирует, активность фермента при этом восстанавливается.

Обратимые ингибиторы делятся на конкурентные и неконкурентные.

Конкурентный ингибитор похож на субстрат по структуре и форме, поэтому может конкурировать с ним за место в активном центре. Степень ингибирования зависит от концентрации субстрата и ингибитора.

Чем больше концентрация ингибитора, тем сильнее ингибирование.

Неконкурентные ингибиторы структурно не похожи на субстрат, поэтому действуют вне активного центра.