Принципи виготовлення поживних середовищ

 

Мікроорганізми для росту, розвитку та розмноження потребують поживні речовини. Здатність до синтезу необхідних речовин та способи одержання енергії в мікроорганізмів різноманітні. Тому для кожної групи характерні особливі вимоги до джерел живлення.

До складу поживних середовищ повинні входити такі елементи

1) біогенні – Карбон, Оксиген, Гідроген, Нітроген,;

2) мінеральні - Фосфор, Сульфур, Калій, Магній, Кальцій, Ферум та ін.

Перелічені елементи повинні бути у формі, яка легко б засвоювалася мікроорганізмами. Карбон найлегше споживається гетеротрофними мікроорганізмами у формі глюкози. Крім глюкози, гетеротрофи засвоюють цукри, спирти, органічні кислоти та інші сполуки. Джерелом Нітрогену можуть бути білкові речовини, пептони, амінокислоти, солі амонію, нітрати. Інші елементи вводяться у формі солей.

У технологіях галузі як джерело Карбону використовують такі сполуки: вуглеводи (глюкоза, сахароза, лактоза, крохмаль), гідрол (залишок після виділення кристалічної глюкози, що містить до 50% редукуючих цукрів), мелясу, мелясну барду, гідролізати деревини та соломи, сульфітні гідролізати, молочну сироватку (містить до 70% лактози), спирти (метанол і етанол) тощо. Очевидно, що різні виробництва потребують різноманітної сировини. Так, для виробництва спирту найчастіше використовують крохмалевмісну сировину - зерно (кукурудзу, пшеницю, жито, тритикале, сорго, ячмінь, овес, просо) і картоплю, цукровмісну сировину - мелясу, цукрові буряки, а також гідролізати деревини та відходи перероблення сільськогосподарських рослин. Молочну сироватку, на якій добре ростуть змішані культури дріжджів і молочнокислих бактерій, використовують для одержання білково-кормових препаратів. Спирти (метанол і етанол використовують для культивування продуцентів лізину тощо.

У промисловості як джерело Нітрогену та факторів росту найчастіше використовують кукурудзяний екстракт, який міститьбілки, амінокислоти, вітаміни та різні елементи. Вміст сухих речовин у ньому становить 46-53%, серед яких 6-8% належить нітрогеновмісним сполукам.

Джерелами Нітрогену є соєве борошно, гідролізати дріжджів і казеїну (джерело амінокислот), екстракти та автолізати дріжджів (джерело вітамінів групи В, піримідинових і пуринових основ), а також висівки (джерело білків, жирів, целюлози та мінеральних елементів) та альбумінове молоко (джерело білків, мінеральних елементів і вітамінів).

Під час виготовлення середовищ необхідно враховувати потребу мікроорганізмів в елементах живлення, а також у факторах росту. Останні найчастіше знаходяться в природних середовищах, таких як дріжджові екстракти чи автоліаати. Джерелом факторів росту можуть бути і розчини вітамінів, амінокислот, пуринових і піримідинових основ.

Поживні середовища повинні бути збалансовані за складом, мати оптимальні вологість, в’язкість, реакцію середовища (рН), окисно-відновний потенціал.

За вмістом компонентів розрізняють такі поживні середовища:

1) натуральні, які містять продукти тваринного та рослинного походження, мають складний і невизначений склад. Наприклад, відвари або екстракти, одержані з м’яса, риби, овочів, грунту, м’ясо, кров, молоко, овочеві та фруктові соки, а також пивне (неохмелене) сусло. Призначення натуральних середовищ - для нагромадження біомаси, підтримування культур мікроорганізмів, діагностичних потреб.

2) синтетичні, які містять певні хімічні речовини у визначених кількостях. Найчастіше у технологіях галузі використовують синтетичне середовище Чапека для дослідження грибів, середовище Рідер - для дріжджів тощо. Синтетичні середовища готують для дослідження обміну речовин, закономірностей росту мікроорганізмів.

3) напівсинтетичні середовища, в яких основним компонентом є синтетичне середовища з добавками продуктів невизначеного складу (пептону, дріжджового автолізату, гідролізату казеїну). Їх використовують для одержання продуктів життєдіяльності мікроорганізмів таких, як: вітамини, антибіотики, амінокислоти тощо.

За призначенням середовища можна розділити на такі:

1) елективні (вибіркові), які забезпечують розвиток лише пених груп мікроорганіізмів, або груп споріднених видів;

2) диференційно-діагностичні (індикаторні), які використовують для одержання нагромаджувальних культур із природних субстратів, диференціювання видів мікроорганізмів та ідентифікації чистих культур на підставі вивчення їх біохімічних властивостей.

За консистенцією поживні середовища бувають рідкими, твердими та сипкими.

Рідкі середовища застосовують для нагромадження біомаси або продуктів метаболізму, підтримання культур мікроорганізмів в активному стані, а також для зберігання тих видів, які погано розвиваються на твердих середовищах. Ці середовища найчастіше використовують у технологіях галузі.

Тверді середовища використовують для аналізу мікрофлори різних об'єктів, виділення чистих культур мікроорганізмів, одержання ізольованих колоній, вивчення їх культуралвних особливостей, кількісного обліку клітин, зберігання в колекціях культур мікроорагнізмів, постачання промислових культур на виробництва. Їх готують із рідких додаванням 1,5-2,5% агар-агару (складного полісахариду) або 10-15% желатину (кислого нірогенвмісного продукту).

Сипкі середовища, до яких належать розварене зерно (пшениця, пшоно), висівки, буряковий жом, жмихи, грунт) застосовують для зберігання деяких видів мікроорганізмів та їх спор, приготування посівного матеріалу – продуцентів фізіологічно активних сполук.

1.2. Способи стерилізації

Перед початком проведення мікробіологічних робіт, зокрема культивуванням мікроорганізмів, необхідно підготувати стерильні середовища, посуд (чашки Петрі, пробірки, піпетки тощо) та інструменти. Стерилізація або знепліднення - це повне знищення вегетативних клітин та спор мікроорганізмів. Для цього використовують термічну та холодну стерилізацію.

Способи стерилізації різноманітні і залежать від властивостей об'єкта.

Автоклавування - стерилізація в автоклавах насиченою парою під тиском вищим від атмосферного (0,05 - 0,2 МПа). Це найуживаніший спосіб стерилізації поживних середовищ і посуду. Температура і тривалість процесу визначається складом поживних середовищ та їх рН. Субстрати, що легко розкладаються при нагріванні, стерилізують при 121°С (тиск 0,05 МПа) протягом 20-30 хв.

Рис. 1. Вертикальний автоклав.

Термолабільні субстрати (молоко, желатинові середовища, середовища з цукрами, вітамінами та ін.) зазвичай стерилізують при 0,5 атм протягом 15-30 хв; пивне сусло та сусло-агар - при 0,7 атм 20 хв; м'ясо-пептонні середовища - при 1 атм 20 хв. Перестерилізація поживних середовищ може призвести до зміни рН, потемніння, зниження густини гелю, агару і желатину; цукри можуть розкластися.

У промислових умовах виготовлені середовища найчастіше стерилізують нагріванням парою і ретельно перемішують у спеціальних реакторах із мішалками. Час і режим прогрівання залежить від типу середовища та його складу. Виготовлені середовища часто стерилізують безпосередньо у ферментерах при +121°С протягом 30-40 хв.

Поетапна стерилізація полягає в нагріванні поживного середовища при температурі 100°С тричі протягом 30 хв три доби підряд. Короткочасне кип'ятіння знищує вегетативні клітини мікроорганізмів. Витримування середовищ протягом доби при кімнатній температурі або в термостаті при температурі 30°С дає можливість прорости життєздатним спорам. Утворені з термостійких спор вегетативні клітини гинуть при наступному кип'ятінні.

Пастеризація - це знищення, головним чином, аспорогенних мікроорганізмів одноразовим нагріванням до температури нижчої від 100°С. Цей сплосіб був запропонуваний Л.Пастером. Пастеризацію зазвичай проводять при 60-75°С протягом 15-30 хв або при температурі 80°С протягом 10-15 хв. Інколи матеріал нагрівають до 90°С й одразу швидко охолоджують. Режим пастеризації визначається термостійкістю субстрату, можливістю інфікування його мікроорганізмами і метою роботи.

Цей спосіб стерилізації застосовують для продуктів і середовищ, які при дії вищих температур зазнають докорінних змін, втрачають якості та поживну цінність.

Тиндалізацію, запропонованоу Д. Тиндалем, здійснюють обережним нагріванням при 50-80°С протягом 30-60 хв п’ять діб підряд або при температурі 55-58°С протягом 30-60 хв. шість-сім діб підряд.

Хімічну стерилізацію використовують для дезінфекції приміщень, обладнання, столів тощо. Для стерилізації цим методом застосовують солі важких металів (найчастіше ртуті, міді, цинку), 50-70% розчин етилового спирту, 8-оксихіноліну, лізол, формалін (41% розчин формальдегіду), хлорне вапно, хлорамін, Н₂О₂, КМпО₄, β-пропіолактон, йод, йодоформ, озон й інші хімічні сполуки.

Хімічну стерилізацію застосовують для знищення мікроорганізмів у системах водопостачання передусім питної води. Для цього питну воду хлорують. Останнім часом запропоновано використовувати озон, який є сильним окиснювачем, має високу мікробоцидну дію і не спричиняє змін хімічного складу води.

Приміщення (для посівів та пересіві, іноді виробничі тощо), інколи вироби з термолабільних пластмас стерилізують за допомогою ультрафіолетових променів у діапазоні 260-280 нм. Час опромінення, який встановлюють експериментальне, залежить від потужності бактерицидної лампи та розмірів об'єкта стерилізації.

Стерилізацію рідких поживних середовищ, які не витримують навіть незначного нагрівання (зокрема сироваток, рідких середовищ і розчинів, до яких входять термолабільні білки, вітаміни, цукри) здійснюють методом фільтрування. Спосіб полягає у пропусканні рідин через спеціальні дрібнопористі фільтри, діаметр пор яких менший за розміри бактерій. Останні затримуються на поверхні фільтрів. У лабораторіях як бактерійні фільтри використовують: мембранні (колоїдні) фільтри, виготовлені на основі нітроцелюлози або ацетату целюлози; азбестові фільтри Зейтца, виготовлені зі суміші азбесту з целюлозою; скляні фільтри, виготовлені із фрагментів дрібнопористого скла „Пірекс" шляхом сплавлювання; фільтри Нутча і лійки Бюхнера, в які впаяно скляні фільтри. У промисловості метод фільтрування використовують рідко.

2. ХІД ВИКОНАННЯ РОБОТИ

2.1. Підготовка посуду до стерилізації

 

Основні етапи підготовки посуду до стерилізації.

1. Лабораторний посуд (колби, пробірки, чашки Петрі, піпетки) перед стерилізацією ретельно миють, ополіскують дистильованою водою і висушують у термостаті.

2. Готують ватно-марлеві корки. Посуд (колби і пробірки) закривають ватяними корками для того, щоб після стерилізації забезпечити його стерильність. Отвори верхньої частини піпеток також закривають ватними корками, а ворсинки вати можна спалювати у полум’ї. Варто зазначити, що 2/3 ватного корка повинна знаходитися у пробірці і лише 1/3 – поза пробіркою. В іншому випадку пробірки втрачають стерильність

3. Перед термічною стерилізацією посуд загортають у папір. Для цього на столі розстеляють аркуш щільного паперу, на який кладуть дві і більше чашок Петрі., і щільно загортають у вигляді конверта. Підписують на папері дату стерилізації. Кожну колбу загортають у папір і підписують зверху об’єм колби і дату стерилізації.

4. Піпетки спочатку сортують за об’ємом (1, 2, 5, 10 см³). Нарізають смужки паперу розміром 2-3х50-70 см. Далі загортають щільно кожну піпетку серпантином, починаючи з тупого кінця. Підписують зверху об’єм і дату стерилізації.

5. Скляний посуд стерилізують у термостаті за температури 180⁰С протягом 60 хв або за температури 160⁰С - 150 хв. при використанні парового стерилізатора (120⁰С) термін скорочується до 20-30 хв.