Складні методи забарвлення. Забарвлення бактерій по Граму

Мета роботи: Ознайомлення з методикою забарвлення бактерій по Граму.

 

Теоретичні основи: Складні або диференційовані способи забарвлення бактерій за­сновані на особливостях фізико-хімічної будови мікробної клітини. Ці способи забарвлення використовуються для вивчення клітинних структур, а також для характеристики та ідентифікації мікроорганізмів.

На відміну від простих методів забарвлення при користуванні складними методами використовуються декілька барвників. До складних методів забарвлення відносять забарвлення по Граму, Цилю-Нільсену, Нейссеру, Романовському-Гімзе.

Найбільш універсальним з усіх складних методів забарвлення є метод забарв­лення по Граму. Він має важливе діагностичне значення при визначенні видів бактерій. Усі бактерії за цим методом поділяються на дві групи: грам позитивні (Г⁺) та грамнегативні (Г^-). Складність методу полягає в тому, що одні клітини утворюють міцний, не розчинний у спирті, комплекс барвника генцианвіолета з йодом або іншого барвника трифенілметанового ряду (кристалічний фіолетовий, метиленовий фіолетовий). Ці мікроорганізми забарвлюються барвником у фіолетовий колір та належать до грампозитивних організмів. Клітини інших мікроорганізмів після обробки генцианвіолетом та йодом знебарвлюються спиртом та забарвлюються у рожевий колір при додатковому забарвленні фуксином. Такі мікроорганізми складають групу грамнегативннх бактерій.

Основну роль у забарвленні грає клітинна стінка, будова якої у Г⁺ та Г^- мікроорганізмів має принципові відмінності. У Г⁺ бактерій муреїновий каркас багатошаровий та складає до 90% усієї маси стінки. При обробці клітин спиртом відбувається розбухання пептидоглікану та зменшення діаметра пор клітинної стінки, що приводить до зни­ження її проникної здатності, у тому числі і для барвника.

У Г^- бактерій пептидоглікан одношаровий, рідше двошаровий. Зовнішня мембрана клітинної стінки Г^- мікроорганізмів також не є значним бар'єром на шляху проходження барвника, бо при обробці спиртом відбувається розчинення та вимивання ліпідів, що значним чином збільшує проникність клітинної стінки.

Здатність клітин забарвлюватися по Граму залежить від ряду причин та, насамперед, залежить від віку культури. Для забарвлення по Граму доцільно брати молоді, 8 - 24 годинні, клітини, бо при старінні культури у популяції збільшується кількість мертвих клітин, які завжди забарвлюються грамнегативно.

 

Матеріали, реактиви й устаткування:

Предметні скельця, бактеріологічні петлі, пробірки зі стериль­ною водопровідною водою, сірники, сухе пальне, фільтрувальний папір, імерсійна олія, мікроскопи, розчин кислого фуксину, генциан-віолет, метиленовий синій, 96% етиловий спирт, розчин люголю, добові культури мікроорганізмів.

 

Хід роботи:

Забарвити по Граму суміш клітин Г⁺ та Г^- мікроорганізмів.

Забарвлення по Граму проводится таким чином:

1. Па фіксований мазок наносять краплю генциан-віолету або метиленового синього. Забарвлення проводиться протягом 1 - 2 хвилин.

2. Зливаємо барвник та, не промиваючи мазок водою, наносимо розчин люголя на одну хвилину (до почорніння препарату).

3. Зливають розчин люголя та промивають мазок спиртом на протязі 30-50 секунд, постійно похитуючи предметне скельце.

4. Препарат промивають водою.

5. Далі на мазок наносять фуксин та забарвлення проводять на протязі 1-2 хвилин.

6. Зливши розчин фуксину, препарат промивають водою, висушують фільтрувальним папером та мікроскопують. При правильному за­барвленні грампозитивні бактерії забарвлюються генцианвіолетом в синьо-фіолетовий колір, грамнегативні - в додатковий червоний колір фуксином.

Контрольні питання:

1. За яким принципом бактерії поділяються на грампозитивні та грамнегативні?

2. Методика забарвлення бактерій по Граму.

3. В чому полягає різниця між простим та складним методами забарвлення?

4. Чому грампозитивні бактерії забарвлюються в синій колір, а грамнегативні – в рожевий?

 

Форма звітного бланка до лабораторної роботи №4.

Група	Курс	Лабораторна робота №4
		Складні методи забарвлення. Забарвлення бактерій по Граму
Прізвище студента
1) Рисунок суміші мікроорганізмів …………………………………… (назва препарату мікроорганізмів латинською) 2) Заповніть таблицю Забарвлення клітин при внесенні барвників та реактивів Внесений барвник, реактив Колір клітин Г+ Г- Генциан-віолет (метиленовий синій)     Розчин люголю     Спирт 96%     Фуксин       2) Відповідь на контрольні питання 3) Висновки по лабораторній роботі №4
Роботу прийняв		Дата		Підпис

 

 

7. Лабораторна робота №5

Методи стерилізації

Мета роботи: Ознайомлення з методами стерилізації поживних середовищ, посуду, одягу.

Теоретичні основи: Стерилізація - один з найважливіших прийомів у мікробіологічній практиці. В практичній роботі стерилізацію трактують, як методи які застосовують для знищення всіх форм життя як на поверхні, так і всередині об' єктів стерилізації. Стерилізують поживні середовища, посуд,
інструменти з метою не допустити розвитку сторонніх мікроорганізмів у досліджуваних культурах. Розрізняють стерилізацію: термічну, хімічну,
фільтруванням та опроміненням.

 

1. Термічна стерилізація

Прожарювання вогнем (фламбування) застосовують безпосередньо
перед використанням для стерилізації петель, голок, пінцетів, ножиць,
шпателів, скляних паличок, предметних та покривних скелець та іншого
дрібного інструменту.

Кип'ятіння у воді використовують для стерилізації шприців, голок,
пінцетів, скальпелів, дрібного скляного посуду, фільтрів у стерилізаторах.
При цьому гинуть, в основному, вегетативні клітини, спори бактерій
зберігають життєздатність.

Пастеризація - одноразовий короткочасний прогрів матеріалу при
температурах, нижчих 100°С для знищення вегетативних форм
мікроорганізмів. Цей прийом запропонував Луї Пастер. Пастеризацію
часто застосовують у харчовій промисловості, для обробки продуктів, які
втрачають смакові і поживні якості при кип'ятінні: молока, овочевих і
фруктових соків, вин, пива та ін. Пастеризацію зазвичай проводять при
60°С-75°С протягом 15-30 хв чи при 80°С 15 хв. Інколи нагрівають
матеріал до 90°С і одразу ж охолоджують.

Дробна стерилізація використовується для стерилізації середо­вищ, які псуються під дією температур вище 100°С. Цей метод був запропонований англійським вченим Тиндалем. Принцип тиндалізації заснований на використанні багаторазового прогріву сере­довищ текучою парою (у парі киплячої води при температурі 100 ^оС протягом 30 - 40 хвилин). Обробку текучою парою проводять 3 рази у автоклаві з незагвинченою кришкою. Час прогріву відмічається з моменту енергійного виділення пари. У проміжках між прогріваннями, середовища вміщують у термостат (температура 28 - 30 ^оС) для пророщування спор. Середовища, які не витримують нагрівання при 100°С, прогрівають більш обережно при 60 – 80 ^оС4 - 5 хвилин.

Стерилізацію сухим жаром при температурі 170°С, 160°С або
140°С здійснюють у сушильних шафах відповідно протягом 1 год, 2 год та
3 год. Нагрівання за допомогою сухого жару справляє значно слабший
вплив на мікроорганізми, ніж волога пара. В той же час можуть серйозно
пошкоджувати такі матеріали, як гума, папір, вата, тканина. Тому цей
прийом переважно використовують для стерилізації предметів, які є
непроникними для пари, зокрема посуду (чашок Петрі, колб, пробірок,
піпеток тощо). Температура в сушильній шафі не повинна перевищувати 170°С,
оскільки у протилежному випадку з вати та деяких сортів паперу можуть
виділятися смолисті речовини, жирні кислоти, які мають здатність
пригнічувати ріст мікроорганізмів. Ці речовини у невеликих кількостях
також можуть виділятися й при значно нижчих температурах, а при
охолодженні шафи осаджуватись на її стінках. Тому час від часу слід
очищувати стінки печі. Для попередження інтенсивного змішування холодного забрудненого повітря зі стерильним вмістом шафи, її небажано
відкривати до охолодження.

Стерилізація насиченою парою під тиском (автоклавування) -
найбільш надійний і широко застосовуваний спосіб стерилізації поживних
середовищ і посуду. Цей метод ґрунтується на нагріванні матеріалу
насиченою водяною парою під тиском, вищому від атмосферного. Відомо,
що температура пари зростає при підвищенні її тиску. Наприклад, при
тиску 1,5 атм. температура пари становить 127°С, 2 атм. - 135°С.

Автоклавування забезпечує високу ефективність стерилізації: гинуть
вегетативні клітини, і найстійкіші спори. Стерилізацію парою під тиском
здійснюють у спеціальних герметичних товстостінних апаратах -
автоклавах (рисунок 5.1).

1 – стерилізаційна камера; 2 – кран для виходу повітря; 3 – манометр; 4 – запобігаючий клапан; 5 – водо парова камера; 6 – лійка для заповнення автоклаву водою; 7 – водомірна трубка; 8 – отвір для проходження пари в стерилізаційну камеру; 9 – захисний кожух; 10 – кришка автоклаву; 11 – підставка для розміщення стерилізуємих предметів.

Рисунок 5.1 – Схема автоклаву

 

Для правильного автоклавування необхідно повністю витіснити
повітря з робочої камери, оскільки повітря затримується між предметами,
які автоклавуються, внаслідок чого вони можуть не нагріватися до заданої
температури. Крім того, заповнювати автоклав слід таким чином, щоб не
перешкоджати вільному рухові повітря.

Перед стерилізацією поживні середовища і посуд слід ізолювати від
зовнішнього середовища. Для цього колби і пробірки закривають ватними
пробками: чашки Петрі, піпетки, шпателі загортають у папір чи кладуть у
паперові пакети. Посуд, зазвичай, стерилізують при 1 атм. 20-30 хв.

Температура і тривалість автоклавування поживних середовищ
визначається, перш за все, їх складом. Термолабільні субстрати (молоко,
желатинові середовища, середовища з цукрами, вітаміни тощо) зазвичай
стерилізують при 0,5 атм., протягом 15-30 хв, пивне сусло та сусло-агар-
при 0,7 атм 20 хв, м'ясо-пептонні середовища при 1 атм. 20 хв.

Працювати з автоклавом слід обережно, дотримуючись інструкцій.
Оскільки автоклав - апарат, який працює при високому тиску і високій
температурі, неправильна експлуатація його може бути причиною нещасних
випадків. Для роботи з автоклавом допускаються тільки особи, які мають
спеціальну підготовку і дозвіл відповідної інстанції.

Для контролю правильного режиму стерилізації використовують
кілька методів: за допомогою прямого вимірювання температури,
максимальних термометрів або хімічних індикаторів. Перший спосіб
здійснюють за допомогою термопар, розташованих в різних частинах
камери. Зручнішим є використання максимальних термометрів та
патентованих хімічних індикаторів. Останні змінюють своє забарвлення
внаслідок прогрівання протягом певного часу при заданій температурі.

 

2. Хімічна стерилізація

Хімічну стерилізацію використовують для дезінфекції приміщення,
столів, знищення патогенних культур мікроорганізмів тощо.

Для стерилізації цим методом застосовують солі важких металів
(найчастіше ртуті, міді, цинку), 50-60%-ний розчин етилового спирту, -
оксихіноліну, лізол, формалін (41%-ний розчин формальдегіду), хлорне
вапно, хлорамін, пероксид водню, перманганат калію, -пропіолактон, йод,
йодоформ, детергенти та інші хімічні сполуки.

Обладнання, яке має дзеркальні, оптичні поверхні, радіодеталі, а
також вироби з термолабільних пластмас (чашки Петрі, центрифужні
пробірки тощо) стерилізують, застосовуючи газовий метод. Найчастіше
використовують оксид етилену, метилбромід, формальдегід,
- пропіолактон, озон тощо. Газову стерилізацію здійснюють у спеціальних
герметичних апаратах. При стерилізації строго контролюють концентрацію
газу, тиск, вологість, температуру і тривалість обробки, у більшості
випадків процес відбувається при температурі 45°С-70°С. Режим
стерилізації різними газами неоднаковий. Предметами, простерилізованими
газами, можна користуватися лише через 24 години (після десорбції газів).

 

3. Стерилізація ультрафіолетовими променями

Приміщення (стерильні бокси, операційні, реанімаційні), інколи
вироби з термолабільних пластмас стерилізують за допомогою
ультрафіолетових променів у діапазоні 260-280 нм. Час опромінення, який
встановлюють експериментально, залежить від потужності бактерицидної
лампи, від величини об'єкту стерилізації. При обробці УФ-променями
дрібних предметів їх одразу після стерилізації кладуть у стерильний
обгортковий матеріал або стерильний посуд, де і зберігають до
використання.

4. Стерилізація фільтруванням

Метод часто застосовують для стерилізації субстратів, які не
витримують нагрівання, зокрема, сироваток, рідких середовищ і розчинів,
до яких входять термолабільні білки, вітаміни, вуглеводи, деякі
антибіотики. Спосіб полягає в пропусканні рідин через спеціальні
дрібнопористі фільтри, діаметр пор яких менший за розміри бактерій.

У лабораторіях як бактеріальні фільтри використовують:

а) мембранні (колоїдні) фільтри, виготовлені на основі ефірів
целюлози. Це диски різного діаметру товщиною 0,1-0,5 мм. Розміри пор
вітчизняних мембранних фільтрів коливаються в межах від 0,35 до 3,5 мкм.
Фірма "Міліпор" (Франція, США) продукує фільтри з розміром пор від
0,01 до 14 мкм, фірма "Синпор"(Чехія) - від 0,12 до 4 мкм.

На практиці придатність фільтрів для стерилізації встановлюють
шляхом пробного фільтрування через них суспензії дрібних
мікроорганізмів. Для перевірки на стерильність фільтрат у великих кількостях висівають на поживні середовища. Якщо пртягом 5-ти діб тест-мікроорґанізм не проросте, фільтри можуть бути використані для стерилізації.

б) азбестові фільтри Зейца виготовляють з суміші азбесту і целюлози.
Їх недоліком є те, що азбест адсоробує речовини рідини, а фільтрат
забруднюється волокнами.

в) пористі скляні фільтри виготовляють з фраґментів скла "пірекс",
сплавляючи їх диски фільтрів впаяні в скляні лійки - держаки різної
форми. Скляні фільтри нестандартні, тому перед використанням їх
обов'язково перевіряють, як і мембранні фільтри.

Для прискорення фільтрації на фільтрі, зазвичай, створюють перепад
тисків, якого найчастіше досягають відкачуванням повітря з допомогою
вакуумного насоса чи компресора.

Серйозним недоліком цього способу стерилізації є те, що фільтрування
через будь-який фільтр, окрім видалення з розчину суспендованих у ньому
частинок, може також призвести до різкої зміни властивостей фільтрату.
Так, при фільтруванні може змінюватись рН розчину, у
фільтрат можуть потрапляти різного роду іони, гліцерин тощо.

 

Матеріали, реактиви й устаткування: автоклав, сухо-жаровий стерилізатор, стерилізатор водний, чашки Петрі, колби, піпетки, шпателі, бум ага для загортання посуду, вата, марля, нитки.

Хід роботи:

В ході роботи необхідно ознайомитися з будовою автоклава та сухо-жарового стерилізатора, приготувати ватно-марлеві пробки, підготовити та простерилізувати посуд.

1. Приготування ватно-марлевих пробок.

Для приготування пробки плоский шматок вати, узятий уздовж
волокна, скачують валиком. Щоб додати пробці міцність,
неї прокочують між долонею й чистим склом, що лежить на
столі. Довжина пробки для звичайної пробірки приблизно 4 см. Пробка повинна входити в пробірку на 1,5—2,0 см (рисунок 5.2). Для зберігання форми пробку виймають із пробірки, злегка обертаючи.
Зручно обернути пробку чистою марлевою серветкою.

А – правильно приготовлена пробка;

Б, В – Неправильно приготовлені пробки

Рисунок 5.2 – Ватні пробки

 

Перед стерилізацією пробки можна прикрити паперовими
ковпачками. Не можна обертати пробки посуду, який буде
стерилізуватися в автоклаві, целофаном, фольгою або іншими
матеріалами, що не пропускають пару, тому що пара повинна обов’язково проникати через пробку в посуд, інакше середовища не нагріються до потрібної температури й не простерилізуються. При використанні скляних, гумових, коркових й інших пробок їх огортають у подвійний шар обгорткового паперу й стерилізують при в'язаними до склянки, закритою ватяною пробкою. Пробки в посуді міняють стерильно в полум'ї пальника.

 

2. Підготовка посуду до стерилізації.

а) пробірки закривають ватно-марлевими пробками та об’єднавши по три штуки огортають папером та перев’язують нитками;

б) колби закривають ватно-марлевими пробками, на які зверху надівають паперові ковпачки;

в) шпателі кладуть у паперові конверти;

г) піпетки загортають в полосу паперу шириною 4-5 см, попередньо в піпетку зверху поміщають шматок вати;

д) чашки Петрі загортають в папір по 3 штуки.

Весь посуд та інструменти перед підготовкою та стерилізацією повинні бути вимиті та просушені.

3. Стерилізація.

Весь посуд та інструменти кладемо в сухо-жаровий стерилізатор на 2 год при температурі 160°С

Контрольні питання:

1. Визначте поняття «стерилізація».

2. Назвіть види стерилізації.

3. Як стерилізуються продукти, які не переносять нагрівання вище 100°С?

4. Як стерилізується приміщення, поверхня меблів та одяг працівників мікробіологічної лабораторії?

 

Форма звітного бланка до лабораторної роботи №5.

 

Група	Курс	Лабораторна робота №5
		Методи стерилізації
Прізвище студента
1) Принцип роботи автоклава 2) Відповідь на контрольні питання 3) Висновки по лабораторній роботі № 5
Роботу прийняв		Дата		Підпис

 

 

Лабораторна робота № 6