Бактеріологічне визначення мікробіоценозу товстої кишки щурів

Зібрані фекалії масою 1 г чи ділянку товстої кишки площею 1 см² миттєво погружали в пробірки зі стерильним буферним фізіологічним розчином (рН 7,2 – 7,4). Далі, готували робоче розведення випорожнень 1:10 додаючи в пробірку 10 мл буферного фізіологічного розчину (рН 7, 2 – 7, 4), відбирали 1 мл рідини і додавали прогомогенізовані фекалії чи кишку до мітки на пробірці, ретельно розтираючи за допомогою скляної палички. Зразки калу чи ділянки товстої кишки відразу ж розводили послідовно в стерильному фізіологічному розчині (від 10 ^-1 до 10 ^{– 8}). Висів проводили на відповідні поживні агаризовані середовища Бактеріологічною петлею роблять посів на тверді поживні середовища (Ендо, Плоскірєва, вісмут-сульфіт-агар) для виділення патогенних ентеробактерій та 1-2 мл середовища накопичення - селенітовий бульйон. Для дослідження мікробіоценозу кишківника готували відповідні розведення. Переносили 0,1 мл зависі із пробірки з робочим розведенням (1:10) в 9,9 мл буферного фізіологічного розчину. Ресуспендувати завись 6-8 разів, перенесли 0,1 мл в наступну пробірку з 9,9 мл буферного фізрозчину. Таким чином готували розведення до 10^-7, кожен раз змінюючи піпетки. Висів на відповідні поживні середовища проводили за нижче вказаною схемою:

1) із розведення 10^-8 1,0 мл висівали на дно пробірки із регенерованим (35 – 40 хвилин) і охолодженим до 50 ºС середовищем Блаурока;

2) із розведення 10^-7 0,1 мл висівали на середовище МРС і 1,0 мл на регенероване середовище Блаурока;

3) із розведення 10^-5 по 0,1мл висівали на середовища МРС, для лактобацил, Сімонса та 0,05 мл на 5 % кров'яний агар;

4) із розведення 10^-3 по 0,1 мл висівали на середовищах Сабуро і ЖСА.

Режим інкубації: посіви на середовищах Ендо, 5 % кров'яному агарі, Сімонса інкубують протягом 18- 24 год при температурі 37 ºС.

Посіви на середовищі ЖСА інкубували протягом 48 год при 37 ºС з попереднім переглядом через 24 год. інкубації.

Посіви на середовищі Сабуро інкубували протягом 48 год. при 37 ºС та 3 доби при температурі 18 ºС.

Середовище МРС з посівали досліджуваних зразків інкубували в ексикаторі зі свічкою при температурі 37 ºС 48 год.

Посіви на середовищі Блаурока інкубували 48 год при температурі 37ºС. Для виявлення дисбактеріозу кишечнику проводили кількісний облік колоній, що виросли на 5 % кров'яному агарі, ЖСА, середовищах Ендо, Сабуро, Сімонса та МРС.

Кількісний склад усіх мікроорганізмів в 1,0 г фекалій визначали за формулою:

S= n×a×b,де

S – кількість мікроорганізмів 1,0 г фекалій;

n – кількість колоній, що виросли на чашці Петрі;

a – коефіцієнт посівної дози (при посіві 0,1 = 10; 1, 0 = 1; 0, 05 мл = 20)

b – ступінь розведення матеріалу.

Через 18–24 год росту на чашці з 5 % кров'яним агаром відмічали тільки гемолітичні форми кишкової і кокової мікрофлори, підраховували їх відсоток від загальної кількості колоній, що виросли на цій чашці, також враховували гемолітичні види УПЕ. Всі види колоній відбирали для подальшої ідентифікації.

При паралельному посіві однакової кількості матеріалу на середовища Ендо і Сімонса через 18 – 24 години відмічали кілька варіантів результатів:

- на середовищі Сімонса - ріст відсутній, на середовищі Ендо – лактозопозитивні із металічним блиском колонії. Це означає, що у даному матеріалі УПЕ немає. Після підрахунку колоній і аглютинації їх із сироваткою ОКА, дослідження припиняли, оскільки такий варіант характерний тільки для присутності кишкової палички;

- на середовищі Сімонса – голубі колонії, колір середовища змінений; на середовищі Ендо виявляли лактозопозитивні колонії. Це означає, що в матеріалі присутні УПЕ, у цьому разі із середовища Ендо відбирали на середовище Олькельницького і скошене середовище Сімонса всі типові колонії, попередньо підрахувавши їх. Із чашки з середовищем Сімонса відбирали типові колонії на середовище Олькельницького;

- на середовищі Сімонса ріст відсутній, на середовищі Ендо виявляли суміш лактозопозитивних і лактозонегативних колоній. У даному випадку підраховували усі типи колоній та ідентифікували лактозонегативні колонії.

На наступний день порівнювали результати ферментації середовища Олькельницького відколотими колоніями, що були зняті із середовищ Ендо і Сімонса, враховуючи при цьому реакцію на скошеному середовищі Сімонса. У випадку одноразового результату проводили дослідження на один біохімічний ряд для кінцевої ідентифікації. Якщо на середовищі Олькельницького варіант «лактоза–кислота, глюкоза –кислота –газ, сечовина–(-), сірководень – (-)», а росту на скошеному середовищі Сімонса немає, тоді після аглютинації культури із сироваткою ОКА дослідження припиняли, оскільки такий варіант характерний тільки для кишкової палички.

Культивували мікроорганізми в аеробних та мікроаеробних умовах. Ідентифікацію ентеробактерій та стафілококів проводили за допомогою пластин для біохімічної ідентифікації (ПБДЕ та ПБДС виробництва Нижній Новгород, Росія). Видову ідентифікацію проводили загальноприйнятими методами, використовуючи номенклатуру Берги та відомості узагальнені в керівництвах по клінічній мікробіології [14 ].

Питомий вміст мікроорганізмів виражали кількістю останніх в 1 г калу з розрахунком для кожної групи мікроорганізмів lg (M±m).

Порушення колонізації кишечника оцінювали за методичними рекомендаціями, які були розроблені Інститутом післядипломної освіти ім. Шупика [14].