Методы исследования иммунной системы

Коррекция иммунопатологических процессов в силу различий механизмов их развития не может быть одинаковой и должна предваряться проведением методов исследования иммунной системы, позволяющих максимально точно установить вариант иммунопатологического процесса.

Для установления характера иммунопатологических изменений необходимы специальные методы диагностики иммунной системы. Эти методы выполняются в рамках специального раздела иммунологии, а именно - в рамках иммунодиагностики. Иммунодиагностика - это развивающаяся область, она постоянно обновляется, на смену устаревшим методам приходят более совершенные технологии и приёмы. Методы иммунодиагностики используются не только для исследования иммунной системы, инфекционных заболеваний, но и для диагностики онкологических процессов, заболеваний эндокринной системы и многих других. Отчасти это связано с вовлечённостью иммунной системы в самые разные по этиологии и патогенезу заболевания в рамках единства нейро-иммуно-эндокринной регуляции гомеостаза, отчасти - с использованием иммунологических подходов в изготовлении реактивов, тест-систем для исследования практически любых молекул и клеток.
Все методы диагностики состояния иммунной системы можно разделить на несколько групп. Некоторые методы выполняются врачом клинической практики, другие - специалистами в области инструментальной диагностики, третьи - специалистами лабораторного профиля. В силу разнообразия используемых методов диагностика состояния иммунной системы осуществляется на многоуровневой основе.
1-й уровень имеет ориентировочное значение и предназначен для констатации наличия вероятности неадекватного функционирования иммунной системы. Этот уровень - клинический, он предполагает сбор анамнеза пациента, изучение его жалоб и установление клинических маркёров изменённой функции иммунной системы путём физикального осмотра. Как правило, заподозрить нарушение функции иммунной системы можно при наличии у пациента частых (свыше 4 раз в год) и длительных респираторных инфекций, которые протекают без температурной реакции, при длительном субфебрилитете, снижении или существенном увеличении массы тела, наличии гнойничковых заболеваний кожи, наличие признаков аллергии, при нарушении функционирования желудочно-кишечного тракта, увеличении регионарных лимфоузлов и др.
При физикальном осмотре врач обращает внимание на состояние кожных покровов, волос и ногтей, состояние слизистых оболочек полости рта, на размеры и консистенцию регионарных лимфоузлов, селезёнки. По результатам данного обследования можно предположить изменение функции иммунной системы и целенаправленно продолжить диагностику её состояния.
2-й уровень диагностики - инструментальный. Он используется не всегда, поскольку его возможности ориентированы на визуализацию различных внутренних органов, включая органы иммунной системы. К методам инструментальной диагностики относят рентгенологическое, ультразвуковое исследование и смежные с ними методы. Их диагностическая ценность связана с обнаружением объёмных образований или изменения размеров органа, что чаще всего сопровождает опухолевые процессы (в рамках патологии иммунной системы - лимфопролиферативные процессы).
3-й уровень диагностики - лабораторный. Именно этот уровень позволяет получить максимум информации о функционировании молекул и клеток иммунной системы, что чрезвычайно важно для постановки диагноза патологии иммунной системы или определения её вовлечённости в патологический процесс.
Для лабораторного исследования наиболее часто используется кровь, возможно и желательно использование слюны, ликвора, синовиальной жидкости, мочи (можно определить уровень некоторых цитокинов) а также материалов, полученных при биопсии регионарных лимфоузлов, красного костного мозга.
В принципе, все перечисленные материалы можно условно разделить на 2 группы:

· универсальные материалы, которые исследуются у каждого пациента с предполагаемым нарушением функции иммунной системы (периферическая кровь),

· специализированные материалы, исследуемые в отдельных случаях и представляющие собой, как правило, материал из очага патологического процесса.

Периферическая кровь, как биологический материал для исследования, отличается доступностью для взятия, но имеет ряд ограничений в плане достоверности и диагностического значения получаемой информации. Кровеносная система является лишь одной из транзитных для лимфоцитов систем. В кровеносном русле находится не более 0,5 % всех имеющихся в организме лимфоцитов и их изучение не всегда позволяется получить информацию о состоянии иммунной системы, так как большинство процессов физиологической и патологической активации этих клеток осуществляется на территории органов иммунной системы или различных тканей. Поэтому уровень значимости получаемой информации различен при разных патологических состояниях, а для получения достоверной информации о состоянии иммунной системы нужен комплекс методов.
Среди лабораторных методов, используемых в целях иммунодиагностики, особое место занимают:

1. Методы, основанные на детектировании клеток и молекул иммунной системы с помощью маркированных моноклональных антител (МАТ). В основе этих методов - получение с помощью гибридомной технологии моноклональных антител к конкретным молекулам. Полученные моноклональные антитела маркируют флуорохромом, радиоактивным изотопом или иным способом и, используя основное свойство антител - способность связываться с антигеном, детектируют исследуемые молекулы на отдельных клетках, биопсийных образцах тканей или в других материалах. Для детекции связывания исследуемой молекулы с МАТ нужно специальной оборудование: если МАТ маркировано флуорохромом, то регистрацию результатов осуществляют с помощью люминесцентного микроскопа, но эффективнее - с помощью проточного лазерного цитофлуориметра. Если МАТ маркированы радиоактивным изотопом, то результаты регистрируют с помощью счётчиков ионизирующего излучения, или с применением авторадиографии. Иммуноферментный метод, метод иммуноэлектронной микроскопии, иммуноцитохимии и иммуногистохимии также относятся к данной группе методов. Внедрение этой группы методов позволило проводить иммунофенотипирование для определения принадлежности клеток иммунной системы к той или иной субпопуляции, а также проводить качественное и количественное определение практически любых белковых молекул и гаптенов. Поэтому области применения этой группы методов далеко перешагнули пределы иммунодиагностики и даже медицины;

2. Серологический метод. Этот метод также применяется на основе взаимодействия антиген-антитело, но в случае визуально детектируемого взаимодействия. Т.е. в тех случаях, когда взаимодействие антигена с антителом проходит как специфическую, так и неспецифическую фазу, формируя видимый невооружённым глазом макромолекулярный комплекс в виде агглютинатов или преципитатов (см. лекцию Антитела). Этот метод преимущественно используется для диагностики некоторых инфекционных заболеваний (для определения уровня антигенспецифических антител или антигенов возбудителя), для определения групп крови, а также для определения С-реактивного белка и некоторых других провоспалительных белков, циркулирующих в кровеносном русле в достаточно высокой концентрации. Серологический метод прост, не требует специального оборудования, но уступает предыдущей группе методов в точности, воспроизводимости, специфичности и разрешающей способности, поэтому постепенно утрачивает своё значение;

3. Молекулярно-генетические методы (полимеразная цепная реакция - ПЦР, метод молекулярной гибридизации с использованием ДНК-, РНК-зондов, реакция секвенцирования). В основе этих методов - исследование отдельных генов, детекция мутаций. Молекулярно-генетические методы применяют для подтверждения первичных (врождённых) иммунодефицитов, для определения гаплотипа главного комплекса гистосовместимости при выявлении риска развития аутоиммунных процессов, для обнаружения в биологическом материале генома микроорганизмов и др.;

4. Культурально-биологические методы. Это также большая группа методов, предполагающих применение в качестве вспомогательных реагентов клеток животных (эритроцитов барана, например), микроорганизмов (для определения фагоцитарной активности часто используются стафилококки, кандиды). Кроме этого в процессе проведения исследования применяется культивирование клеток иммунной системы в лабораторных условиях. Обычно эта группа методов применяется для оценки функциональной активности клеток иммунной системы.

Перечисленные методы в обычном режиме иммунодиагностики используются для определения иммунного статуса человека.

Иммунный статус - это состояние иммунной системы в конкретный промежуток времени. Исторически сложилась двухуровневая система оценки иммунного статуса.

На 1-м уровне используют самые простые тесты, позволяющие обнаружить выраженные изменения показателей. 2-й уровень предполагает применение более совершенных методов и тестов, позволяющих получить более полную информацию о состоянии иммунной системы. Однако в настоящее время этот подход также постепенно вытесняется из практики. Это связано с разработкой более совершенных технологий, а также продвижением в изучении основ развития патологии иммунной системы. Так, для исследования иммунного статуса всё чаще применяется иммунопатогенетический подход, когда в большей степени учитываются результаты клинического исследования и клинических лабораторных анализов и из всего спектра иммунодиагностических тестов выбираются наиболее показательные и специфичные:

· для диагностики иммунодефицитных состояний после первичного клинического обследования проводят полное исследование иммунного статуса (см. лабораторный практикум по иммунологии для студентов 3 курса, лабораторную работу № 8). При подозрении на наличие первичного (врождённого) иммунодефицита диагноз подтверждают молекулярно-генетическим исследованием, направленным на детекцию мутаций или отсутствие конкретных генов. В случае вторичных иммунодефицитов инфекционного генеза диагноз подтверждают выявлением инфекционного агента (обычно в ПЦР или обнаружением антигенов возбудителя и антител к ним с помощью иммунохимического или серологического методов);

· для диагностики лимфопролиферативных процессов широко применяются инструментальные методы, позволяющие визуализировать объёмное образование (опухоль) лимфатической системы, исследуют иммунологический фенотип лимфоцитов крови, клеток красного костного мозга и/или биоптата из обнаруженной опухоли. Фенотипирование клеток позволяет установить стадию их дифференцировки. Диагностика включает также анализ хромосом и молекулярно-генетическое исследование маркёров ряда опухолей лимфатической и кроветворной систем, а также секретируемых некоторыми видами опухолей продуктов (например, лёгких цепей иммуноглобулинов) с помощью различных вариантов иммунохимических методов. Показатели иммунного статуса в данном случае не имеют особого диагностического значения для подтверждения диагноза лимфопролиферативного процесса, но необходимы для представления о функционировании всех компонентов иммунной системы в условиях лимфопролиферативного заболевания;

· для диагностики аллергий осуществляют определение специфичности главного патогенетического фактора - IgE, благодаря чему устанавливается, какое вещество является для пациента аллергеном. Для установления особенностей патогенеза аллергии определяют концентрацию в биологических материалах (крови, слюне, моче, слёзной жидкости, носовом секрете и проч.) биологически активных компонентов тучных клеток (гистамина, триптазы, химотриптазы и др.). Диагностическое значение имеет также исследование продукции интерлейкина-4 и ряда других показателей. Показатели иммунного статуса являются вспомогательными критериями, они, как правило, не имеют непосредственного отношения к аллергии;

· для диагностики аутоиммунных заболеваний патогенетически важно определение аутоантител определённых специфичностей (иммунохимическим или серологическим методом), а также общего уровня иммуноглобулинов разных классов, концентрации ЦИК, определение активности системы комплемента, концентрации провоспалительных белков (С-реактивного белка, церулоплазмина, ревматоидного фактора и др.). При диагностике аутоиммунных заболеваний используют исследование биоптатов тканей, в которых определяют наличие фиксированных иммунных комплексов или их компонентов. Определение других параметров иммунного статуса не имеет определяющего значения в диагностике аутоиммунных процессов.

Результаты иммунодиагностического исследования в дальнейшем используют для установления нозологической формы заболевания и назначения лечения. В лечении иммунопатологических процессов большое место занимает иммунокорригирующая терапия, или иммунокоррекция.