Б. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам

а) Метод дисков. Бумажные диски, пропитанные определенными антибиотиками, поме­щают на газон исследуемой бактериальной культуры в чашке Петри, По­севы инкубируют в течение 16-24 часов, после чего учитывают результаты опыта по образованию зон задержки роста бактерий.

По диаметру зон задержки роста ориентировочно судят о степени чувствительности бактерий к антибиотикам (рис. 2). Зона задержки роста до 15 мм указывает на слабую, до 25 мм - на среднюю и свыше 25 мм - на вы­сокую чувствительность. Более точные результаты получают при исполь­зовании метода серийных разведений.

б) Метод серийных разведений. Этот метод позволяет определить минимальную задерживающую концентрацию антибиотика для данного микроорганизма (МЗК) как на жидких, так и на плотных питательных средах.

МПБ разливают по 2 мл в серию пробирок. Готовят основной раствор антибиотика, для чего берут навеску антибиотика и растворяют в дис­тиллированной воде из расчета 1 мг антибиотика на мл растворителя.

Левомицетин предварительно растворяют в 96° этиловом спирте из расчета 0,25 мл спирта на 1 мг антибиотика; после полного растворе­ния добавляют такое количество дистиллированной воды, чтобы раствор содержал в 1 мл 1 мг антибиотика.

Тетрациклин и окситетрациклин растворяют в сантинормальном раст­воре соляной кислоты из расчета 1 мл на 1 мг антибиотика.

Эритромицин сначала растворяют в чистом метиловом спирте из расчета 1 мл на 10 мг эритромицина. После растворения добавляют такое количество дистиллированной воды, чтобы получить раствор, содержа­щий в 1 мл 1 мг антибиотика.

Исходный раствор антибиотика в количестве 2 мл вносят в первую пробирку с МПБ, перемешивают и получают определенную его концентра­цию.

Из первой пробирки 2 мл разведенного антибиотика переносят во вторую пробирку и после перемешивания переносят 2 мл в третью пробирку и т.д. до предпоследней, откуда 2 мл выливают. Последняя пробирка является контролем, в ней нет антибиотика и она свидетельству­ет о пригодности среды для роста культуры.

После разведения антибиотика во все пробирки вносят по 0,1 мл испытуемой бульонной культуры. Для этого используют 3-4-часовые или 18-часовые культуры, разведенные МПБ в 50 раз.

Пробирки помещают в термостат на 12-18 часов, но предваритель­ные результаты можно учитывать через 6-8 часов.

По истечении необходимого срока инкубации определяют максималь­ное разведение антибиотика, которое еще подавляет рост культуры. Концентрация антибиотика в последней пробирке с видимой задержкой роста и представляет собой минимальную задерживающую концентрацию антибиотика (МЗК) или минимальной подавляющей концентрацией (МПК).

Штамм считается чувствительным к антибиотикам, если МЗК препа­рата для данного штамма соответствует концентрации этого препарата, создаваемой в организме. Измеряется МПК в мг/л или мкг/мл (рис. 1).

Минимальная подавляющая концентрация (МПК) - наименьшая концентрация антибиотика (мг/л или мкг/мл), которая in vitro полностью подавляет видимый рост бактерий.

Рис. 1. Определение значения МПК методом разведения в жидкой питательной среде.

в) Определение чувствительности микроорганизма с помощью Е-теста проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (рис. 3). В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК).

 

Рис. 2.Зоны задержки роста при дисковом методе определения чувствительности к антибиотикам	Рис. 3. Определение чувствительности микроорганизмов с помощью Е-тестов

 

 

Несомненным достоинством диффузионных методов является простота тестирования и доступность выполнения в любой бактериологической лаборатории. Однако с учетом высокой стоимости Е-тестов для рутинной работы обычно используют диско-диффузионный метод.

З А Н Я Т И Е5

Дата ______________

 

Тема: Микробиологическая диагностика дифтерии и коклюша

План занятия:

1. Изучение морфологии и культуральных свойств дифтерийной палочки. Макро- и микроскопия культур бактерий.

2. Типы дифтерийных бактерий. Разбор особенностей роста культур соответствующих типов на теллуритовых средах.

3. Биохимические свойства коринебактерий. Дифференциация истинных дифтерийных бактерий от псевдодифтерийных и дифтероидов по биохимическим свойствам. Демонстрация и разбор.

4. Правила взятия и пересылки материала от больного дифтерией для бактериологического исследования. Разбор.

5. Бактериологическая диагностика дифтерии. Разбор схемы исследования дифтеритической пленки (или материала от бактерионосителя).

6. Определение токсигенности дифтерийных бактерий реакцией преципитации в агаре и биопробой на морской свинке. Разбор и демонстрация.

7. Изучение морфологии и культуральных свойств коклюшной палочки.

8. Микробиологическая диагностика коклюша. Разбор схемы.

9. Знакомство с иммунопрепаратами, применяемыми для профилактики и лечения дифтерии и коклюша.

 

Методические указания

1. Готовые фиксированные мазки из чистой культуры дифтерийной палочки окрасить синькой Леффлера и по Нейссеру. Дифтерийные бактерии окрашиваются неравномерно, более интенсивно окрашиваются зерна волютина. При окраске метиленовым синим наблюдается явление метахромазии. По способу Нейссера зерна окрашиваются в темно-коричневый цвет. Дифтерийные палочки располагаются под углом друг к другу в виде римской цифры V. Препараты промикроскопировать и зарисовать.

Знакомство с характером роста возбудителя дифтерии на свернутой сыворотке, на теллуритовых средах.

2. Разбор особенностей колоний различных типов дифтерийной палочки на теллуритовой среде – форма, размеры, цвет, блеск. Характер их роста на жидких средах - помутнение, осадок, пленка.

3. Знакомство с биохимическими свойствами дифтерийной палочки по биохимическим наборам. Демонстрация и разбор. Заполнить таблицу.