Специальные методы микроскопии.

В разделе 8 мы получили выражение (5), известное как дифракционный предел разрешения микроскопа. Повторим его здесь:

                             Z _min = λ / 2 n                                         (5)

Эта формула обозначает две возможности уменьшения предела разрешения Z _min:

   1. Увеличение показателя преломления n среды, в которой работает объектив микроскопа. Эту возможность заметил и применил еще Роберт Гук (тот самый; 1678 год). 

   2. Уменьшение длины волны  λ излучения, формирующего изображение в микроскопе.

       Достижения в микроскопии по этим направлениям рассматриваются в последующих разделах.

 

 

Иммерсионный микроскоп.

      Иммерсионный метод наблюдения в оптической микроскопии (от латинского immersion - погружение) основан на введении иммерсионной жидкости в пространство между объективом и рассматриваемым предметом, с целью увеличения яркости и уменьшения предела разрешения микроскопа.

      Главная характеристика иммерсионной жидкости – ее показатель преломления: чем он больше, тем лучше, желательно, чтобы он был близок к показателю преломления материала объектива (который тоже желательно иметь побольше).

       На рис. 17 показан схематически объектив микроскопа в двух вариантах его работы:

- на левой половине рис. 17 – «сухой» объектив в воздушной среде;

- на правой половине – он погружен в иммерсионное масло.         

             

 

 

       Рис.17.  

Обратите внимание: во-первых, показатели преломления объектива, иммерсионного масла и предметного стекла практически одинаковы;

во-вторых, изучаемый объект расположен под покровным стеклом, и от него начинается световой конус лучей, идущих на линзу объектива.

Насколько эффективней оказывается правая половина схемы рис. 17

в сравнении с левой, «сухой» половиной? Наш результат (4) вычислений предела разрешения получен для «сухого» объектива; вот он: Z_м = 300 нм. Введение иммерсионного масла уменьшает предел разрешения практически в полтора раза, до значения Z = 200 нм. Несколько капель масла – и вот такой существенный прогресс!

      При этом полезное увеличение возрастает: с прежнего значения 1000 до нового значения 1500. (см. пример вычисления полезного увеличения микроскопа). Это означает, что иммерсионный объектив позволяет все тому же подслеповатому наблюдателю полноценно работать на микроскопе, дающем увеличение до значения 1500. Но – внимание! – это должен быть другой микроскоп! Дело в том, что при введении иммерсионной жидкости улучшается предел разрешения объектива, но ухудшаются некоторые другие его характеристики. Поэтому иммерсионные микроскопы выпускаются с оптикой, рассчитанной на применение строго определенной иммерсионной жидкости, а от использования его в «сухом» варианте толку мало.

 11.2. Волновые свойства электронов. Предисловие к 11.3.

      Изобретение электронного микроскопа оказалось возможным только после того, как у электронов было установлено наличие волновых свойств.

      Гипотеза о наличии волновых свойств у частиц вообще. и у электронов в частности, была высказана в 1924 году Луи де Бройлем. Он предположил, что установленный незадолго до этого корпускулярно-волновой дуализм света является свойством всеобщим, то есть относится не только к электромагнитным излучениям, но и к частицам вещества.

      Он предложил простую математическую формулу, которая отражает великие достижения физики на начало ХХ века, в применении к свету:

   - Максвелл: свет – это электромагнитная волна; ее скорость равна с; *

   - Макс Планк: концепция квантов; энергия кванта: Е = h υ = h c / λ;   *

   - Эйнштейн: связь массы и энергии – знаменитая Е = m c².                  *

Свою формулу де Бройль предположил универсальной, справедливой и для квантов света, имеющих в вакууме скорость с= 3·10⁸ м/с, и для частиц массой m, имеющих скорость v. Применительно к частице, формула де Бройля имеет следующий вид:

                                 λ = h / p = h / m v                                         (8)

Здесь h – постоянная Планка; h = 6,62 ‧10 ^-34 Дж‧ с;

     p = m v - импульс частицы;

     λ – дебройлевская длина волны – длина волны, которая, по гипотезе

де Бройля, должна быть свойственна этой частице.

 

       Продвинутому студенту: убедитесь, что формула (8) удовлетворяет свойствам света, помеченным знаками (*).

     Попутно, зная собственную массу, вычислите собственную дебройлевскую длину волны.

     Гипотеза де Бройля была высказана в опережение эксперимента, и первоначально была воспринята скептически. Но все изменилось, когда были опубликованы результаты экспериментов по дифракции электронов на кристаллической решетке никеля (американцы Дэвиссон и Джермер, 1926 год). Эти результаты подтвердили наличие у электронов волновых свойств; при этом длина электронных волн оказалась соответствующей формуле де Бройля (8). После этого изобретение микроскопа, работающего на электронных волнах, по аналогии с оптическим микроскопом на световых волнах, оказалось делом близкого будущего:

     1926-й год: изобретение магнитной линзы для фокусировки потока электронов (Х. Буш, Германия). Это изобретение не имело прямого отношения к волнам де Бройля, но вскоре пригодилось при разработке электронного микроскопа. 

     1931-й год: создан первый электронный микроскоп (Кнолл, Руска. Германия). Он давал увеличение всего лишь в 400 раз.

 

 11.3. Электронный микроскоп.

 

     Схема просвечивающего электронного микроскопа представлена на рис. 18. Кратко характеризуем основные элементы схемы.

Функции осветителя в электронном микроскопе (ЭМ) выполняет электронная пушка. На схеме она почти не показана; можно понять только то, что она является верхней частью всего устройства. Но ее функции исключительно важны.

      Электронная пушка является источником свободных электронов, формирует их узкий пучок, разгоняет электроны до высоких значений скорости.

    Такие же задачи решали (и решают) электронные пушки электронно-лучевых трубок (ЭЛТ) старых телевизоров и компьютерных мониторов. Но отличия пушек ЭМ от пушек ЭЛТ есть, и они весьма существенны.

    В ЭМ борьба за получение сверхтонкого электронного луча начинается с применения миниатюрных источников электронов. Применяются V-образные вольфрамовые нити, испускающие электроны при нагревании небольшим электрическим током (термоэлектронная эмиссия). Применяются и холодные катоды в виде острой иглы, на которой создается большой отрицательный потенциал (автоэлектронная эмиссия).

 

              Рис.18.           

    В электронной пушке разгон электронов происходит в высоковольтном электрическом поле. В пушках ЭЛТ старинных телевизоров анодное напряжение – порядка 10 – 20 кВ. В ЭМ применяют напряжение порядка 100 – 200 кВ. В некоторых моделях ЭМ рабочее напряжение доходит до миллиона вольт. Здесь логика такова: кинетическая энергия электронов пропорциональна ускоряющему напряжению; чем больше скорость электронов, тем меньше дебройлевская длина волны электронов (8), меньше предел разрешения ЭМ и больше его увеличение.

   В колонне микроскопа поддерживается достаточно глубокий вакуум: остаточное давление воздуха составляет 10^-5 мм ртутного столба. Это необходимо, чтобы избежать рассеяния электронов. На создание вакуума уходит довольно много времени, но главная проблема, связанная с вакуумом, состоит в том, что исследуемый образец не может быть живым: в вакууме он заведомо неживой и обезвоженный, к сожалению для биологов и медиков. 

 

    Чем тоньше формируемый в пушке электронный луч, тем больше силы взаимного отталкивания рядом летящих электронов (закон Кулона). Чтобы электронный луч был сверхронким до самого контакта с изучаемым предметом, в схеме ЭМ на выходе электронной пушки предусмотрена магнитная конденсорная линза (рис. 18).          

 

   Магнитная линза представляет собой электромагнит, обмотки которого находятся в массивном корпусе с сердечником из мягкого железа. Этим достигается многократное усиление магнитного поля, созданного обмотками. Электронный луч проходит через узкий канал в корпусе линзы. При изменении тока в обмотках изменяется фокусное расстояние линзы, что приводит к сужению или расширению электронного луча, увеличению или уменьшению площади объекта, освещаемой электронами.

  Если одной такой линзы недостаточно, устанавливают друг за другом две-три конденсорные линзы. Дополнительные линзы способствуют уменьшению размеров освещенной области объекта, что ведет к повышению яркости ее окончательного изображения (ЭМ увеличивает не весь образец, а его малую часть, и ее освещенность повышается).

          

      Взаимодействие электронов с объектом имеет следующие особенности. На изображение, даваемое микроскопом, «работают» электроны, проходящих вблизи атомов вещества объекта и отклоняющихся сообразно свойствам объекта. Но кроме этого, электроны (будучи как-никак и частицами тоже) могут испытывать неупругие столкновения, приводящие к появлению светового или рентгеновского излучения, к большому тепловыделению. Перегрев образца может привести к существенному изменению его свойств, вплоть до его разрушения, а также к нарушению «чистоты вакуума» в ЭМ. Зато излучения, сопутствующие основным процессам в ЭМ, могут дать дополнительную информацию о свойствах исследуемого образца.

         

       Объективная магнитная линза ЭМ – аналог объектива оптического микроскопа. В обоих типах микроскопа именно объектив определяет предел разрешения. Дифракция электронов на атомах образца приводит к их рассеянию на большие углы, так что угловая апертура магнитного объектива       

достаточно велика и предел разрешения достаточно мал (см. табл. 2).                                                                                                           
          

      Чтобы ЭМ обеспечивал возможность установки увеличения в широком диапазоне его значений (например, от 10х до 200 000х), между объективной и проективной линзами приходится устанавливать промежуточную линзу.

 

      Аберрации магнитных линз те же, что и оптических.

      Хроматическая аберрация обусловлена разбросом значений скорости электронов в луче, созданном электронной пушкой. Последствия – разброс значений фокусного расстояния линзы для электронов с разной скоростью и нечто в роде радужного ореола у изображения ЭМ.

       Сферическая аберрация в ЭМ, как и в ОМ, обусловлена различием увеличения, достигаемого в параксиальных лучах и в лучах, к таковым не относящихся.

      Астигматизм – расплата за любую асимметрию в обмотках, в деталях конструкций, в настройках чего угодно и где угодно. Устраняется долгим изнурительным трудом.

      Чтобы настройки ЭМ могли завершиться еще при жизни исследователя, на схеме рис. 19 предусмотрена возможность контролировать промежуточное изображение. В некоторых моделях ЭМ предусмотрена не одна, а две-три такие «смотровые площадки». Напомним, что вся колонна ЭМ работает в условиях вакуума, так что выходы на «смотровые площадки» должны иметь технические возможности минимально и ненадолго нарушать этот вакуум.

 

     Окончательное изображение в ЭМ создает проекционная магнитная линза ЭМ – аналог окуляра оптического микроскопа, с тем отличием, что она дает действительное, а не мнимое изображение. Увеличенное электронное изображение ЭМ преобразуется в видимое с помощью люминесцентного экрана: кинетическая энергия электронов преобразуется в световую энергию молекул люминофора. Это слабоконтрастное изображение обычно рассматривается с помощью бинокулярного микроскопа. Возможна, конечно, фото- и видеорегистрация люминесцентного экрана, с последующим использованием всех благ, даваемых компьютером. Но разрешающая способность фотоматериалов гораздо выше, чем люминесцентного экрана. Поэтому визуальное изучение люминесцентного экрана обычно сочетается с регистрацией на фотопластинке: замена одного на другое – через герметичный люк корпуса микроскопа. Фотопластинка позволяет добиться получения дополнительной информации об исследуемом объекте с помощью фотоувеличителя.