Основы технологии белковых изолятов из дрожжей

В общем виде схема получения белковых изолятов включает следующие стадии:

• дезинтеграция биомассы;

экстракция белка и внутриклеточных компонентов;

удаление нуклеиновых кислот;

удаление липидов;

сушка изолята.

Для дезинтеграции клеток предложено большое количество механических, физических, химических и биохимических (ферментативных) методов, а также их комбинации.

Механическое разрушение клеток может быть осуществлено с помощью различного рода дезинтеграторов и молекулярных мельниц. По принципу действия механические дезинтеграторы подразделяют на баллистические, экструзионные и декомпрессионные.

Баллистический дезинтегратор представляет собой камеру, наполненную полимерными, стеклянными или металлическими шариками, вращающимися одно- или многолопастной мешалкой со скоростью 3000 —9000 об/мин-1. В камеру подается суспензия биомассы, и при вращении шариков происходит разрушение клеток. Степень разрушения клеток в баллистических дезинтеграторах достигает 95%.

В декомпрессионных дезинтеграторах суспензия биомассы насыщается газом при давлении около 15 МПа, после этого давле­ние мгновенно сбрасывается, в результате чего происходит разрушение клеток. Степень разрушения клеток в таких дезинтеграторах достигает 85 %.

В экструзионных дезинтеграторах разрушение клеток происходит при продавливании суспензии биомассы через микрофильеры под давлением 50—80 МПа. При этом обеспечивается степень дезинтеграции более 90 %.

Из физических методов широко известна дезинтеграция микробных клеток с помощью ультразвука. Этот способ находит широкое применение в лабораторной практике, однако возможность его использования в промышленных масштабах в ближайшее время маловероятна из-за того, что ультразвуковые генераторы соответствующей мощности пока неизвестны.

Из химических методов деструкции биомассы наиболее известны разнообразные варианты обработки щелочами и кислотами, в результате которых не только разрушаются клеточные оболочки, по и экстрагируются внутриклеточные компоненты. Суть их состоит в том, что биомассу микроорганизмов обрабатывают вод­ным раствором щелочи при рН 8—12 или кислоты при рН 1—3 в течение от 30 мин до 2—3 ч.

К недостаткам щелочного гидролиза биомассы следует отнести отмеченные ранее изменения аминокислотного состава белка микроорганизмов.

К биохимическим способам разрушения биомассы относится способ ферментолиза эндо- и экзоферментами. Одним из наиболее популярных способов ферментативного разрушения оболочек клеток является, в частности, обработка биомассы ферментом эндо-б-глюканаэой, однако этот метол недостаточно эффективен из-за того, что клеточные стенки микроорганизмов помимо полисахаридов содержат также белковые и липидные компоненты, не поддающиеся действию этого фермента.

Для более полного ферментативного разрушения клеточных оболочек биомассу микроорганизмов сначала обрабатывают протеолитическими ферментами: пепсином, трипсином, папаимом или фнцином. После обработки этими ферментами их инактивируют, биомассу тщательно отмывают и проводят обработку геми- целлюлазами

Особым способом ферментативного разрушения клеток является создание благоприятных условий для их саморазрушения (автолиза) под действием эндоферментов. Подробно автолиз и ферментолиз дрожжевых клеток будут рассмотрены в следующей главе.

Экстракцию белка можно проводить как кислотами, так и ще­лочами или другими агентами. В частности, японская фирма «Хи­тачи» разработала метод экстракции белка из биомассы дрожжей и бактерий, согласно которому биомассу, подвергнутую химическо­му гидролизу кислотой или щелочью, затем обрабатывают водным раствором мочевины с концентрацией от 2 до 12 г-моль/дм3.

При экстракции белка очень важен его фракционный состав. Согласно классификации Осборна белки по растворимости де­лятся на следующие группы: альбумины — водорастворимые белки; глобулины — белки, не растворимые в воде, но растворимые в водных растворах солей, кислот, щелочей; глютелины — растворимые в кислотах и щелочах; проламины — растворимые в 60—80%-м спирте. Биомасса дрожжей обычно содержит около 80% альбуминов и глобулинов, 20 глютелинов, менее 1 % проламинов. При экстракции белка в водную фазу обычно в том или ином количестве попадают все его фракции.

Однако в качестве белкового изолята обычно используют только глобулиновую и глютелиновую фракции белка.

Как уже указывалось ранее, наряду с белком в водную фазу экстрагируются нуклеиновые кислоты и липиды. Эти компоненты способны соосаждаться с глобулиновой фракцией белка, поэтому после экстракции обычно проводят удаление нуклеиновых кислот.

При получении белковых изолятов из дрожжей в основном применяют два способа денуклеинизации — ферментативный и химический.

Ферментативный способ заключается в том, что рН экстракта доводят до значения 5,5—8,5, а температуру до 45... 55*С (55*С, рН 6). В этих условиях активируются эндонуклеазы, содержащие­ся в растворе, тогда как активация протеаз практически не происходит Нуклеазы гидролизуют высокомолекулярную РНК до ди и тетрануклеотидов, которые теряют способность соосаждаться с белком в изоэлектрической точке.

Химический способ разделения нуклеопротеидного комплекса основан на действии так называемых хаотропных солей, таких, как фосфаты, перхлораты, натриевая соль ТХУ.

Суть метода заключается в том, что после экстракции в раствор внутриклеточных компонентов вносят хаотропную соль в концен­трации 0,5—1 г-моль/дм3 и после кратковременной инкубации доводят рН до изоэлектрической точки белка (рН 4,5). При этом глобулиновая фракция белка выпадает в осадок, а нуклеиновые компоненты остаются в растворе. Например, в качестве такого ре­агента используют дикалиевую или динатриевую соль ортофосфорной кислоты при соотношении белок: соль от 1:0,1 до 1:5. Выход белка в изолят составляет 90 —95%.

Липиды экстрагируются из биомассы в солюбилизированном с белком состоянии и так же, как и нуклеиновые кислоты, соосаждаются с ним. Поэтому после осаждения белков в изоэлектрической точке проводят их обезжиривание спиртами или сжиженными газами. Обезжиренную глобулиновую фракцию белка промывают и сушат.

Процесс экстракций липидов и нуклеиновых компонентов может быть переставлен в начало процесса, т. е. проводится обработка не белка, а биомассы. В частности, фирма «Standart Oil Company» (США) предложила способ, включающий следующие

 стадии:

♦ экстракция нуклеиновых кислот из биомассы дрожжей при рН 8,5—10 и температуре 85...100*С;

♦химическая деструкция биомассы 0,3 н. щелочью при 85... 100*С и экстракция белка;

♦ выделение глобулиновой фракции белка в изоэлектрической

уточке.

Рассмотрим более подробно два реализованных технологических процесса получения белковых изолятов (рис. 22.12).

Первый процесс разработан в ГОСНИИсинтезбелок и включает механическую дезинтеграцию биомассы дрожжей при рН 6,5—9,5, экстракцию белка при рН 8—10, сепарацию экстракта для отделения клеточных стенок.

В супернатанте проводится активация нуклеаз при рН 7 и температуре 50*С, и после часовой инкубации глобулиновая фракция белка осаждается в изоэлектрической точке (рН 4,5). Твердая фаза отделяется и подвергается 2—3-ступенчатой экстракции липидов этанолом, водной промывке и сушке.

Второй процесс был реализован фирмой «Л И КО» (Чехия). Процесс включает следующие стадии: 10%-я суспензия пекарских

 

дрожжей поступает на механическую дезинтеграцию при рН 9—14 и температуре 40*С. Одновременно с дезинтеграцией происходит экстракция белка и внутриклеточных компонентов. Далее следует сепарация для отделения клеточных остатков. Экстракт подтитровывают до рН 4,5—8,5 для активации нуклеаз. После часовой инкубации проводится осаждение белка в изоэлектрической точке (рН 4,5). Осажденный белок отделяют сепарированием, и сгущенная фаза подвергается обработке этанолом для удаления липидов, промывке водой и сушке.

При реализации обеих схем получают белковый изолят, содержащий не менее 80 % белка, не более 2% нуклеиновых кислот и не более 1% липидов. Различия обоих изолятов проявляются только при медико-биологической оценке полученных продуктов. В частности, биологическая ценность изолята, полученного на фирме "ЛИКО" в более жестких условиях, допускающих изменение аминокислотного состава, равна 44—52%, тогда как изолята, выделенного в ГОСНИИсинтезбелок, — 65—70 %.

После осаждения белка в надосадочной жидкости остаются альбуминовая фракция белка, пептиды, нуклеотидные компоненты, соли. Все эти вещества являются ценными продуктами. В частности, альбуминовая фракция белка может быть выделена в виде изолята и использоваться в кондитерской промышленности в качестве заменителя яичного альбумина. Ряд пептидов обладает иммуностимулирующей, психотропной и другими активностями. Нуклеотиды также обладают биологической активностью и могут использоваться в пищевой, медицинской и парфюмерной промышленности.

Для разделения этих компонентов используют ультрафильтрацию.

Принцип метода ультрафильтрации заключается в разделении веществ с различными молекулярными массами путем продавливания их через полупроницаемую мембрану. В настоящее время различными фирмами выпускаются мембраны с молекулярной массой удержания или номинальным лимитом молекулярной массы от 500 до 1 млн Да с диаметром пор 2 * 10^-9—6 * 10^-8.

Использование принципа ультрафильтрации для разделения водорастворимых элементов клетки основано на том, что альбуминовая фракция белка имеет молекулярную массу более 20- 30 тыс. Да, тогда как у пептидов и нуклеиновых кислот она не достигает 10 тыс. Да.

Для разделения пептидных и нуклеотидных компонентов обычно используют хроматографические методы, например ионный обмен.

Известно несколько модификаций способа, разработанного специалистами ГосНИИсинтезбелок.

 

Например, предложен способ переработки биомассы хлебопекарных дрожжей для получения белка с улучшенными свойствами, согласно которому биомассу обезвоженных дрожжей Sacharomyces cerevisiae дезинтегрируют на кавитационной мельнице в этиловом спирте в течение 30 мин. Из высушенного дезинтеграта с помощью 0,2 н. NaOH экстрагируют белково-нуклеиновый комплекс, затем отделяют клеточные оболочки центрифугированием. Из полученного экстракта осаждают белково-нуклеиновый комплекс при рН 4. После отделения осадка цетрифугированием отделяют нуклеиновые компоненты путем растворения в буфере с рН 8,9, добавления раствора экзонуклеазы А-5 и инкубирования в течение 24 ч при 37*С. Белок отделяют путем осаждения в иэоэлектрической точке. Таким образом получают и изолят белка с содержанием нуклеиновых кислот 1,7% и гидролизат нуклеиновых кислот с содержанием 5'-мононуклеотидов 60% и концентрацией таточного белка 2 %,

Согласно другому способу для получения белкового изолята суспензию хлебопекарных дрожжей, содержащую 10% сухого ве

щества ва, измельчают в шаровой мельнице, центрифугируют, осадок суспензируют в 5-кратном количестве щелочного раствора При рН 12,3. Экстракцию белка при одновременном гидролизе нуклеиновых кислот производят при 70*С. После отделения клеточных стенок рН доводят до значения 9 при 10...20 "С и добавля­ют обезжиренное молоко до соотношения в готовом продукте дрожжевого белка и казеина 1:1. Непосредственно после этого минеральной кислотой при рН 4,6 выделяют белок. После центрифугирования белковый осадок промывают подкисленной водой и высушивают. Полученный продукт содержит более 77 % чистого белка, 4,9 % углеводов, 1,7 % липидов и 0,9 % нуклеиновых кислот.

Учитывая относительно невысокую степень очистки (обычно не выше 92—97% содержания основного компонента) и гетерогенность большинства потенциально пищевых белков, а также их высокую реакционную способность и сорбционную активность, считают, что белковые фракции, выделяемые из того или иного сырья, могут содержать ряд вредных и нежелательных для орга­низма веществ, присутствие которых полностью исключает или лимитирует применение таких белков для питания. Белок можно считать пищевым, если доказана его безвредность для организма человека.

Доказательства безвредности белка требуют значительно более продолжительных исследований, чем изучение его функциональных свойств и оценка биологической ценности. Происхождение вредных и нежелательных веществ в белковых препаратах может быть различным. Во-первых, это могут быть вещества, содержащиеся в исходном сырье. К ним относятся, например, ингибиторы пищеварительных ферментов, олигосахариды, избыточные количества нуклеиновых кислот и.т.д. Во-вторых, это могут быть вещества, попадающие в сырье из окружающей среды, например, ионы тяжелых металлов, продукты жизнедеятельности микроорганизмов и т. д. В-третьих, это могут быть и вещества, образующиеся в процессах обработки исходного сырья или выделения из него белка, а также остатки веществ, используемых в этих процессах.

Допустимые пределы содержания нежелательных и антипитательных (или антиалиментарных) веществ зависят от назначения данного белка, его доли в пищевом продукте и рационе питания. Так, они могут различаться для пищевых белков, играющих роль небольших (1—2%) функциональных добавок в пищевых продуктах, и для белков, являющихся основным компонентом пищевого продукта массового потребления и служащих единственным источником белка, например в продуктах питания детей или новорожденных.

Таким образом, основные задачи технологии пищевого белка — это извлечение его из сырья с максимальным выходом при минимальных затратах и потерях других ценных компонентов сырья, минимальное изменение функциональных свойств белка (или их направленное изменение в желаемую сторону), сохранение биологической ценности белка, достижение необходимой степени удаления или дезактивации нежелательных примесей.

Главными лимитирующими аминокислотами белков семян зерновых культур (пшеницы, ржи, кукурузы) являются лизин, триптофан, метионин, поэтому добавление белковых концентратов в рецептуры пищевых продуктов из зерна этих культур приводит не только к восполнению белка, но одновременно и к увеличению содержания незаменимых аминокислот.

Белком обогащают хлеб, крупяные, макаронные, кондитерские изделия. В результате увеличивается их биологическая ценность, улучшаются технологические и вкусовые особенности получаемых продуктов.

При введении добавок руководствуются основным принципом, заключающимся в том, - что белки и белковые продукты с первой лимитирующей аминокислотой добавляют в таком количестве, чтобы общее содержание этой аминокислоты в белке диетических продуктов было сбалансировано с количеством второй лимитирующей аминокислоты в соответствии с аминокислотной формулой потребности. Содержание первой и второй лимитирующих ами­нокислот должно в оптимальной степени соотноситься с количеством третьей лимитирующей аминокислоты и т. д.

В настоящее время наибольшее применение для обогащения пшеничной муки при производстве хлеба и хлебобулочных изделий находит обезжиренная мука из шротов и проростков сои, однако в качестве добавок в различные рецептуры все больше практикуется введение продуктов микробного синтеза.