Правила работы с микроскопом МБР-1

Тема 2.3 Методы микроскопии, техники микроскопии

История развития микроскопа

Самое необходимое оружие в любой лаборатории микроскоп.

Впервые изобретен Галилео Галилеем в 1610 году в Италии. Микроскоп увеличивал в 20 раз.

Роберт Гук усовершенствовал его и использовал для изучения тонкого строения растений. Увеличение микроскопа было в 100 раз, но считается, что микроскоп изобрел в 1673году голландец А.Левенгук(1673). Продавец сукна в свободное время исследовал линзы и с их помощью рассчитывал всевозможные объекты. Его микроскоп увеличивал в 275 раз. В 1673 году Королевское научное общество в Лондоне признало его открытия.

Петр I познакомился с Левенгуком будучи в Англии, заинтересовался микроскопией и привез образцы в Россию.

Расцвет отечественной микроскопии в 70-е годы, когда ЛОМО выпустило большое количество микроскопов.

На протяжении всех лет микроскопы усовершенствовались, но принцип работы не изменялся.

Основные виды микроскопов: световые, электронные, люминисцентные, есть еще ультразвуковые, инфракрасные.

Наиболее распространенные – проходящего света «Биологические». На их основе стереоскопические светлого и темного поля, фазовоконтрастные, поляризационные(2фильтра)

Невооруженным глазом с расстояния 25 см человек различает 1 деталь от другой на расстоянии 0,008мм. Оптические микроскопы в настоящее время увеличивают в 1500-2000 раз. Увеличение ограниченно дифракцией т.к. его разрешающая способность ограниченна длиной светового пучка.

В 1930 год создан электронный микроскоп который дает увеличение в 100 тысяч раз больше светового. За счет малой величины длины волны электронов достигается высокое разрешение.

Впервые в электронном микроскопе был изучен возбудитель полиомиелита, строение митохондрии, ДНК.

 

Строение микроскопа

Микроскоп – оптический прибор, предназначенный для рассмотрения объектов, не видимых вооруженным взглядом

Микроскоп МБР-1 (МБИ-1, «Биолам»)

Имеет механическую и оптическую часть.

К механической части относится: штатив, предметный столик, тубус, револьвер, макро- и микрометрические винты.

К оптической  - окуляр, объективы, конденсор, зеркальце, диафрагма

Окуляр в верхней части тубуса. Увеличение:*7; *10;*15

Объектив   ввинчивается в гнездо револьвера. Различают объектив малого увеличения(*8), объектив большого увеличения (*40), и иммерсионный объектив (*90), используемый для изучения наиболее мелких объектов.

Общее увеличение микроскопа равно увеличению окуляра, умноженному на увеличение объектива

Осветительная часть микроскопа состоит из зеркала, конденсора и диафрагмы.

 

Штатив состоит из массивного подковообразного ос­нования, придающего микроскопу необходимую устойчи­вость. От середины основания вверх отходит тубусодержатель, изогнутый почти под прямым углом, к нему при­креплен тубус, расположенный наклонно.

На штативе укреплен предметный столик с круглым отверстием в центре. На столик помещают рассматриваемый предмет (отсюда название «предметный»). Через отвер­стие в центре столика проходит луч света, позволяющий рассматривать объект в проходящем свете.

На боковых сторонах штатива (ниже предметного сто­лика) находятся два винта, служащие для передвижения тубуса.

Макрометрический винт, или кремальера, имеет боль­шой диск и при вращении поднимает или опускает тубус для ориентировочной наводки на фокус. Этим винтом пользуются при малом (слабом) увеличении, при этом объект изучают в одной плоскости.

Микрометрический винт, имеющий наружный диск меньшего диаметра, при вращении незначительно переме­щает тубус и служит для точной наводки на фокус. Этим винтом пользуются при работе с большим (сильным) уве­личением, что позволяет рассматривать детали и части объекта, лежащие на разной глубине. Микрометрическим винтом пользуются тогда, когда с помощью макровинта объект поставлен точно в фокус. Вращать микрометричес­кий винт можно только вполоборота в обе стороны. Благо­даря разным размерам нужный винт можно найти на ощупь. Микрометрический винт может иметь вид плоской плас­тинки, расположенной на основании микроскопа.

 

Оптическая часть микроскопа представлена окулярами и объективами.

Окуляр (лат. ocullus — глаз) находится в верхней час­ти тубуса и обращен к глазу наблюдателя. Окуляр пред­ставляет собой систему линз, заключенных в металличе­скую гильзу цилиндрической формы. Цифра на верхней поверхности окуляра означает кратность его увеличения (х7, х10, х15). Окуляр можно вынимать из тубуса и по мере необходимости заменять другим. На нижней части тубуса находится вращающаяся пластинка, или револь­вер (лат. revolve — вращаю), имеющий три гнезда для объективов. Как окуляр объектив представляет собой си­стему линз, заключенных в общую металлическую оправу. Объектив ввинчивается в гнездо револьвера. На боковой стороне объектива цифрой обозначена кратность увеличения. Различают объектив малого увеличения (х8), объектив большого увеличения (х40) и иммерсионный объектив (х90), используемый для изучения наиболее мелких объектов.

Общее увеличение монокулярного микроскопа равно увеличению оку­ляра, умноженному на увеличение объектива.

Общее увеличение бинокулярного микроскопа равно: окуляр* на 1,5(собственное увеличение) *объектив. (10*1,5)*8=120

Изображение в микроскопе обратное.

Зеркало укреплено подвижно на штативе ниже предметного столика, благодаря чему его можно вращать в любом направлении. По отношению к источнику света зеркало устанавливают так, чтобы от­раженные им лучи наилучшим образом осветили поле зре­ния микроскопа. Отбрасываемый зеркалом луч света про­ходит через отверстие в центре предметного столика и освещает объект. Зеркало имеет две поверхности — вог­нутую и плоскую. Вогнутая поверхность сильнее концент­рирует световые лучи и поэтому используется при более слабом освещении (искусственный свет).

Конденсор находится между зеркалом и предметным столиком. Он состоит из двух-трех линз, заключенных в общую оправу. Луч света, отбрасываемый зеркалом, Про­ходит через систему линз конденсора. Регулируя положе­ние конденсора (выше, ниже), можно изменять интенсив­ность освещенности объекта. Для перемещения конден­сора используют винт, находящийся впереди микро- и макрометрических винтов. При опускании конденсора ос­вещенность уменьшается, при поднятии (к предметному столику) — увеличивается.

Ирисовая диафрагма, вмонтированная в нижнюю часть конденсора, регулирует освещение. Диафрагма состоит из пластинок, расположенных по кругу и частично перекры­вающих друг друга таким образом, что в центре остается отверстие для прохождения светового луча. С помощью специальной ручки, расположенной на конденсоре с пра­вой стороны, можно менять положение пластинок диаф­рагмы относительно друг друга, уменьшая или увеличивая отверстие. Максимально суженная диафрагма способствует наибольшей четкости изображения, что важно при рас­смотрении прозрачных объектов.

 

 

Техника  микроскопирования

Правила работы с микроскопом МБР-1

При переносе микроскоп рекомендуется брать правой рукой за ручку штатива, а левой поддерживать его снизу.

1. Установите микроскоп так, чтобы его зеркало находилось напротив источника света.

2. Поставьте в рабочее положение объектив малого увеличения. Для этого поворачивайте револьвер до тех пор, пока нужный объектив не займет срединное положение по отношению к тубусу и предметному столику (встанет над отверстием столика). Когда объектив занимает срединное (центрированное) положение, в револьвере срабатывает устройство — защелка; при этом раздается легкий щел­чок, и револьвер фиксируется.

Внимание. Изучение исследуемого объекта начинают с малого увеличения.

3. С помощью макрометрического винта поднимите объек­тив над столиком на высоту примерно 0,5 см. Откройте диафрагму и немного приподнимите конденсор.

4. Глядя в окуляр левым глазом, вращайте зеркало в разных направлениях до тех пор, пока поле зрения не будет освещено ярко и равномерно.

5. Положите на предметный столик исследуемый пре­парат покровным стеклом вверх так, чтобы объект нахо­дился в центре отверстия предметного столика.

6. Наблюдая в окуляр, медленно опустите тубус с помо­щью макрометрического винта так, чтобы объектив на­ходился от препарата на расстоянии около 2 мм.

7. Смотрите в окуляр и медленно поднимайте тубус с помощью макрометрического винта до тех пор, пока в поле зрения не появится изображение объекта (фокусное расстояние для малого увеличения составляет приблизи­тельно 0,5 см).

8. Чтобы перейти к рассмотрению объекта при боль­шем увеличении микроскопа, необходимо центрировать исследуемый препарат, т.е. поместить объект или рассмат­риваемую его часть в центр поля зрения. Смотрите в оку­ляр до тех пор, пока объект не займет нужного положе­ния. Если объект не отцентрирован, то при большом уве­личении он останется вне поля зрения.

9. Вращая револьвер, поставьте над исследуемым пре­паратом объектив большего увеличения. При этом раз­дается легкий щелчок, и револьвер фиксируется.

10. Для тонкой фокусировки используйте микрометри­ческий винт.

11. При зарисовке исследуемого препарата смотрите в окуляр левым глазом, а в альбом — правым.

При изучении в микроскопе мелких объектов использу­ют иммерсионный (лат, immersia — погружать или оку­нать) объектив. При работе с этим объективом на покровное стекло помещают каплю раствора, имеющего показатель преломления такой же, как у стекла. Обычно для этого используют кедровое масло. Между линзой и покровным стеклом не остается воздушной прослойки, и луч света проходит через однородную среду без отклонения. При работе с иммерсионным объективом пункты 8 и 9 правил остаются в силе.

12. Опустите тубус (глядя на него сбоку) так, чтобы ниж­няя линза объектива погрузилась в каплю иммерсионного масла.

13. Затем, глядя в окуляр, с помощью микровинта ос­торожно (фокусное расстояние для объектива х90 еще мень­ше, чем для объектива х40) опускают, а затем поднимают объектив так, чтобы получить четкое изображение.

Внимание! Работа с иммерсионным объективом требует более интенсивного освещения поля зрения.

 

Приготовление препаратов

для микроскопирования

Препараты для микроскопирования готовят из крови, мочи, фекалий, колоний бактерий, тканей животных и рас­тений и пр. В некоторых случаях приготовление препара­тов несложно, в других — требует специальной техники.

Наиболее просто готовят так называемые нативные пре­параты, т.е. объекты в естественном их виде. В этом слу­чае материал наносят на предметное стекло и покрывают тонким покровным стеклом. Иногда его смешивают с изо­тоническим раствором хлорида натрия или глицерином для разжижения, осветления и предохранения от вы­сыхания. Так готовят препараты для микроскопического исследования осадка мочи, мокроты, фекалий.

Широко распространен метод окраски препаратов для микроскопирования. Способ окраски зависят от особенно­стей исследуемого материала и цели исследования.

Различные части препарата воспринимают краску по- разному, что делает их более четкими, позволяет отли­чить друг от друга отдельные структуры. Например, маз­ки крови окрашиваются азур-эозином для подсчета лейко­цитарной формулы, фуксином — для подсчета тромбоцитов, азуром II — для подсчета ретикулоцитов.

Для бактериоскопии — изучения под микроскопом мик­роорганизмов — существует большое количество методов окраски, в том числе и сложных — двумя и более кра­сителями.

Существует негативный метод окраски, т. е. окрашива­ется фон препарата, на котором отчетливо видны неокра­шенные микроорганизмы, например бледная трепонема.

Препарат для микроскопии не может быть толстым или плотным, так как луч света должен хорошо проходить сквозь него. Поэтому приготовление гистологических пре­паратов из тканей требует довольно сложной техники. Ткань обрабатывают спиртами, формалином шли фикси­рующими смесями, пропитывают целлоидином, парафи­ном или желатином. Затем получают тончайшие срезы ткани при помощи специального прибора — микротома. После этого срезы окрашивают гематоксилин-зозином, суданом, сложными смесями красителей, серебром и пр.

 

Специальные методы световой микроскопии

Темнополъная микроскопия (микроскопия в темном поле) основана на использовании специального конденсо­ра, обеспечивающего освещение препарата косыми луча­ми, не попадающими в объектив. В отсутствии объектов поле зрения представляется темным. При наличии объек­тов луч света отражается ими в объектив, в результате чего появляется изображение в окуляре. Метод позволяет выявитьструктуры, размеры которых лежат за пределами разрешения светового микроскопа. Метод может исполь­зоваться для изучения живых клеток.

Фазово - контрастная микроскопия основана на неоди­наковом изменении фазы световых лучей при их прохож­дении через различные структуры изучаемого объекта. Фазово-контрастный микроскоп преобразует незаметные для человеческого глаза фазовые различия в амплитудные. Этот метод позволяет непосредственно изучать живые клет­ки без их фиксации и окрашивания.

Поляризационная микроскопия используется для изуче­ния структур» обладающих свойствами анизотропии, или двойного лучепреломления. В поляризационном микро­скопе на объект направляется поляризованный пучок све­та, который в дальнейшем пропускается через анализа­тор (расположенный между объективом и окуляром) - устройство, определяющее отклонение плоскости поляри­зации света вследствие его прохождения через объект. Тем самым выявляется закономерное пространственное расположение молекул в объекте.

Ультрафиолетовая микроскопия связана с освещением изучаемого объекта ультрафиолетовыми лучами, которые избирательно поглощаются его структурными компонента­ми. Так как ультрафиолетовые лучи имеют более корот­кую длину волны по сравнению с лучами видимой части спектра, разрешающая способность микроскопа увеличи­вается примерно вдвое. Невидимое изображение в ультра­фиолетовом микроскопе преобразуется в видимое с помо­щью люминесцентного экрана или других устройств.

Флюоресцентная {люминесцентная) микроскопия использует способность некоторых веществ излучать види­мый свет при освещении объекта ультрафиолетовыми лу­чами (аутофлюоресценция). В некоторых случаях (напри­мер, при выявлении катехоламинов методом Фалька) флю­оресценция возникает после предварительной химической обработки ткани. Применяют также флюоресцентные кра­сители (флюорохромы), связывающиеся с различными структурами или веществами в клетках и межклеточном веществе. Так, акридиновый оранжевый, связываясь с ДНК, дает свечение желто-зеленого цвета, а с РНК — красно-оранжевого. Флюоресцентные красители связывают (коньюгируют) со специфическими антителами для выявления соответствующих антигенов в тканях иммуногистохимическими методами (см. выше).

 

Практическая часть

Техника микроскопирования

Настройка света: Устанавливаем объектив 8, окуляр7-10. Конденсор поднят, диафрагма открыта. Естественный свет направляем в конденсор плоским зеркалом. Зеркало поворачиваем до тех пор, пока поле зрения не будет равномерно освещено.

Обзорная микроскопия. Рассматриваем под малым увеличением. Объектив 8. Конденсор опущен, диафрагма закрыта. Рабочее расстояние 10-12 мм.

Детальная микроскопия. Объектив 40. Конденсор (приподнят) в среднем положении. Диафрагма в среднем положении. Рабочее расстояние 2-3 мм.

Имерсионная микроскопия. Имерсионное масло. Конденсор поднят. Диафрагма открыта. Окуляр 15. Объектив 90 переводим так, что он погружается в иммерсионное масло. Рабочее расстояние 0,5-1см. Микровинтом устанавливаем фокус.

Режимы микроскопирования:

ü Под малым увеличением ок7об8

ü Микробиологические объекты – ок15об90

ü Подсчет лейкоцитарной формулы – ок15об90

ü Под иммерсией – ок15об90