Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы

Факторы, влияющие на активность ферментов

(скорость ферментативных реакции)

Лабильность, то есть способность ферментов изменять активность в зависимости от различных факторов - температуры. рН среды, активаторов, ингибиторов и т. д., обусловлена, прежде всего, белковой природой ферментов. Степень изменения активности от различных факторов можно оценить по скорости ферментативной реакции.

Мерой скорости ферментативной реакции служит количество субстрата, превращающегося в единицу времени, или количество образовавшегося продукта. При изучении влияния какого-либо фактора на скорость ферментативной реакции должен соблюдаться принцип единого различия, то есть все прочие факторы должны оставаться неизменными и по возможности иметь оптимальные значения.

 

Задание 1. Получение разведенного препарата амилазы слюны

1. Студент-доброволец из каждой группы, ополоснув рот водой 2-3 раза, собирает в пробирку с воронкой слюну определенного объема для каждой задачи.

2. Под контролем лаборанта отбирается определенное количество и разбавляется водой в зависимости от необходимого разведения: например если нужно получить разведение 1:9, отбирается точно 1 мл слюны из пробирки и переносится в центрифужную пробирку и доводится до объем до 10 мл.

3. При необходимости фильтровать раствор в стакан, отметив разведение слюны в 10 раз.

 

Задание 2. Влияние температуры на активность ферментов

 

Температура всегда влияет на скорость реакции. В пределах физиологических условий скорость реакции растёт с увеличением температуры, но выше определенной температуры начинается тепловая инактивация белковой молекулы. Эти явления и объясняют существование температурного оптимума ферментативных реакций. Не все ферменты одинаково меняют свою активность с изменением температуры. Для большинства ферментов, выделенных из организма теплокровных, оптимальная температура равна 37-40 °С. Повышение температуры выше оптимальной приводит к уменьшению, а затем прекращению действия фермента (50-80 °С), что связано с денатурацией белков. Низкие температуры понижают скорость ферментативных реакций, доводя до минимальной величины при 0 °С.

Реактивы:	разбавленная слюна;
	раствор йода в йодиде калия (1:10) 0.3 %-ный (Раствор Люголя);
	раствор крахмала 1 %-ный;

 

Ход работы.

В штативе расположить двумя рядами 8 пробирок (по 4 пробирки в ряду). Во все пробирки одного ряда налить по 3 мл 0,2 %-ного раствора крахмала; во все пробирки другого ряда – по 1 мл разбавленной слюны. Первые пробирки из обоих рядов (одна с ферментом, другая с крахмалом) поместить в кипящую водяную баню, вторые – в термостат при 37-38 °С. третьи – в лёд или снег, четвёртые оставить при комнатной температуре. Через 10 минут содержимое каждой пары пробирок объединить вместе (прилить крахмал к ферменту), тщательно перемешать пробирки с содержимым и оставить в тех же температурных условиях при которых они находились. Этот момент считать началом опыта.

 

В это время взять 3 пробирки, внести в них по 0,5-1 мл воды и по 3 капли раствора йода. Это необходимо для наблюдения за ходом гидролиза крахмала амилазой по реакции с йодом.

По истечении 5 минут инкубации из пробирки, стоящей при комнатной температуре, отобрать 0,2-0,3 мл инкубируемой смеси и внести её в одну из пробирок с раствором йода. При появлении синего или фиолетового окрашивания, все пробирки оставить в тех же условиях еще на 5 минут. После истечения этого времени реакцию с йодом повторить. В случае появления краевых или жёлтых тонов окраски содержимого пробирки, стоящей при комнатной температуре, инкубацию прекратить и сразу же в каждую пробирку добавить по 3 капли раствора йода, содержимое перемешать и охладить/подогреть до комнатной температуры.

Глубину гидролиза крахмала определить по окраске с раствором йода, результат записать в таблицу.

 

Растворы, условия опыта	Температура
	0 ºС (лед)	20-25 ºС (контроль)	37 ºС (термостат)	100 ºС (кипящая баня)
Слюна	1 мл	1 мл	1 мл	1 мл
Крахмал 0,2 %	3 мл	3 мл	3 мл	3 мл
Поместить	эксикатор со льдом	оставить в штативе на столе	в термостат	в кипящую баню
	Экспозиция 10 минут
	Слить вместе и оставить в тех же условиях,  в которых находились пробирки
Раствор Люголя	1-2 капли	1-2 капли	1-2 капли	1-2 капли
Окраска с йодом
Название обнаруженных на основании окраски с йодом продуктов *

 

Через 1 минуту инкубации отбирать из пробирки на столе по 0,3-0,5 мл и вливать в приготовленную заранее пробирку содержащую 1 каплю раствора Люголя. Смотреть через каждые 30 секунд. При появлении бурой окраски быстро раскапать йод во все опытные пробирки, предварительно охладив под струей воды пробирки из термостата и кипящей бани. Зафикисировать развитие окраски.

* При гидролизе крахмал распадается, давая последовательно декстрины, мальтозу и глюкозу. В начале гидролиза образуются амилодекстрины, дающие синее окрашивание с йодом, затем эритродекстрины, дающие с йодом красно-бурое окрашивание и, наконец, ахродектрины, не окрашивающиеся йодом. Продуктом гидролиза последних является мальтоза, которая распадается в дальнейшем на две молекулы глюкозы.

Таблица – Цветные реакции декстринов с йодом

 

Декстрин (С6Н10О5) k	Степень полимеризации k	Окраска комплекса с йодом
Амилодекстрины	>30	Синяя или фиолетовая
Эритродекстрины	25–29	Красная
Ахродекстрины	21–24	Желто-коричневая
Мальтодекстрины	<20	Отсутствие реакции

1 2 3

(1 – из картофеля, 2 – из кукурузы, 3 – из пшеницы)

Рисунок – Зерна крахмала из разных природных источников под микроскопом

 

Углеводы	Mr	Степень полимеризации	Редуцирующая способность,%
Растворимый крахмал	208000	1300	0,073
Амилодекстрины	10000	61	0,5
Эритродекстрины	6000	38	2,5
Ахродекстрины	3200	20	5,0
Тетрасахариды	661	4	25
Трисахариды	504	3	33
Мальтоза	342	2	60
Глюкоза	180	1	100

На основании полученных данных построить график скорости ферментативной реакции от температуры. При построении графика по оси ординат, начиная от нуля, обозначить цвета в следующей последовательности: синий, фиолетовый, красный (объединяя все его тона), желтый; по оси абсцисс - температуру, обозначив разрыв между 40 и 100 °С.

Сделать вывод о влиянии температуры на активность амилазы.

Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы

 

Растворы, условия опыта	Температура
	0 ºС (лед)	20-25 ºС (контроль)	37 ºС (термостат)	100 ºС (кипящая баня)
Слюна	1 мл	1 мл	1 мл	1 мл
Крахмал 0,2 %	3 мл	3 мл	3 мл	3 мл
Поместить	эксикатор со льдом	оставить в штативе на столе	в термостат	в кипящую баню
	Экспозиция 10 минут
	Слить вместе и оставить в тех же условиях,  в которых находились пробирки
Раствор Люголя	1-2 капли	1-2 капли	1-2 капли	1-2 капли
Окраска с йодом
Название обнаруженных на основании окраски с йодом продуктов *

Растворы, условия опыта	Количество растворов
	Опыт 1	Опыт 2	Контроль
Слюна	1 мл	1 мл	1 мл
Вода	-	-	3 мл
1% NaCl, капель	2	-	-
1% CuSO4, капель	-	2	-
1% Крахмал, капель	5	5	5
Экспозиция, 5 мин
р-р I2 в KI, капель	1	1	1
Результат окраски
Вывод

 

Задание 3. Влияние рН среды на активность ферментов

на примере амилазы слюны

Большинство ферментов характерным образом изменяют свою активность в зависимости от рН. Оптимальной активности фермента соответствует определённая область рН, при которой достигается максимальная скорость реакции; уменьшение и увеличение рН приводит к снижению последней. Для различных реакций значения оптимума рН колеблются в широких пределах от сильно кислой среды до сильно щелочной.

Зависимость ферментативной активности от pН определяется значением рК ионизирующих групп белковой молекулы, особенно тех, которые находятся в активном центре или вблизи него, а также групп, ответственных за изменение состояния активного центра путём конформационных изменений белковой молекулы. Кроме того, рН может влиять на степень ионизации или пространственную организацию субстрата.

 

и раствор йода в йодиде калия (1:10) 0,3 %-ный (раствор Люголя);

слюна разбавленная 1:9 (фильтрованная);

раствор крахмала 1 %-ный.

растворы для приготовления смесей с заданными значениями рН

 

Приготовление буферных растворов с различными значениями рН среды

(берете готовые на лабораторном столе)

 

№ пробирки	0,2 М растворы фосфата натрия, мл		Значение рН смеси
	Раствор 1. Двузамещенный	Раствор 2. Однозамещенный
1	2,5	47,5	5,8
2	10	40	6,2
3	30	20	7,0
4	40	10	7,4
5	47,5	2,5	8,0

 

Буферные растворы готовятся лаборантом 1 раз на весь поток. После смешивания фактическое значение рН определить на рН-метре. Добавлением раствора № 1 или № 2 максимально приблизить к заданной рН.

 

Ход работы.

 

Перед началом работы определить активность амилазы слюны. Для чего в пробирке смешать 1 мл 1 % -ного раствора крахмала и 0,25 мл разбавленной 1:9 профильтрованной слюны. Смесь оставить при комнатной температуре. Наблюдение за ходом гидролиза крахмала проводить по реакции с раствором йода. Для чего через каждые 5 минут отбирать по 3-4 капли гидролизата и вносить его в пробирку с заранее налитым туда 0,5 мл воды и 3 каплями раствора йода. При появлении красно-бурой или красной окраски наблюдение прекратить. Желательно, чтобы гидролиз крахмала до эритродекстринов (красные тона окраски) происходил приблизительно за 10-15 минут. Если гидролиз идёт быстрее, то слюну нужно разбавить ещё в 2 раза и опыт повторить. Найденное разбавление слюны использовать для работы.

В каждую из 5 пронумерованных пробирок внести по 2 мл буферного раствора с определённым значением рН: 5,8; 6,2; 7,0; 7,4; 8,0 или близкими к каждому из этих значений. Пипетку после внесения каждого буферного раствора промывать! Во все пробирки добавить по 2 мл 1 %-ного раствора крахмала и по 0,5 мл слюны подобранного для определения pН разбавления. Содержимое перемешать и оставить при комнатной температуре. Наблюдения за ходим гидролиза крахмала вести по реакции с раствором йода согласно методике, описанной в предыдущем опыте. Отбор проб производить из пробирки № 3 (рН 7.0) через каждые 5 минут. При появлении красного или жёлтого окрашивания содержимого сразу же во все пробирки внести по 3 капли раствора йода. Содержимое перемешать, результат внести в таблицу.

 

Влияние рН среды на активность амилазы слюны

Показатели	Номера пробирок
	1	2	3	4	5
Показатели рН	5,8	6,2	7,0	7,4	8,0
Окраска с йодом

 

При оформлении работы записать значения рН. указанные на флаконах. По результатам работы построить график зависимости активности амилазы слюны от рН и сделать вывод. При построении графика по оси ординат, начиная от нуля, обозначить цвета в следующей последовательности: синий, фиолетовый, красный (объединяя все его тона), желтый; по оси абсцисс - рН.

Задание 4. Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов с определением активности по Вольгемуту

Активность большинства ферментов в значительной степени зависит от природы и концентрации некоторых ионов и низкомолекулярных веществ (могут быть промежуточные или конечные метаболиты реакций), присутствующих в биологической жидкости. Одни из них - активаторы - повышают активность ферментов, другие – ингибиторы угнетают действие ферментов. Механизм их действия может быть аллостерическим или конкурентным.

 

Реактивы. Растворы: крахмала 1 %-ный,

хлорида натрия 1 %-ный,

сульфата меди (II) 1 %-ный,

йода в йодиде калия (1:10) 0,3% -ный (раствор Люголя).

 

Ход работы.

1 мл слюны смешать с 3 мл воды (разбавление 1:4), профильтровать через бумажный фильтр если необходимо и использовать для дальнейшей работы. В штативе расположить тремя рядами 18 пробирок по 6 пробирок в каждом ряду. Пробирки каждого ряда пронумеровать и во все внести по 1 мл воды. Затем в первую пробирку каждого ряда добавить по 1 мл фильтрата слюны, содержимое хорошо перемешать и 1 мл смеси из пробирки 1 перенести в пробирку 2. Содержимое тщательно перемешать и 1 мл смеси из пробирки 2 перенести в пробирку 3 и т. д. Из последней пробирки каждого ряда 1 мл смеси после тщательного перемешивания вылить. Таким образом, получается ряд разведений, в котором содержание слюны в каждой следующей пробирке в 2 раза меньше, чем в предыдущей.

После разбавления во все пробирки первого ряда прилить по 1 мл воды (контрольный ряд), в пробирки второго ряда — по 1 мл 1 %-ного раствора сульфата меди (II), в пробирки третьего ряда по 1 мл 1 %-ного раствора хлорида натрия. Затем во все пробирки прилить по 1 мл 1%-ного раствора крахмала. В следующем порядке: сначала в первые пробирки всех рядов, затем во вторые пробирки всех рядов и т. д. Содержимое пробирок тщательно перемешать и поместить н термостат при температуре 37-38 ºС на 20 минут. По окончании инкубации в пробирки каждого ряда добавить по 3 капли раствора йода в том же порядке, в каком приливался раствор крахмала.

Содержимое перемешать и отметить в каждом ряду номера пробирок, в которых реакция на крахмал отрицательная (пробирки с жёлтым окрашиванием). Результаты опыта занести в таблицу, обозначив жёлтые тона буквой «Ж», красные (красно-коричневые) - «К», фиолетовые - «Ф» и синие - «С».

По полученным результатам определить активатор и ингибитор. Разделив степень разведения контрольной пробы, в которой реакция с йодом отрицательная, на степень разведения проб, давших отрицательную реакцию с исследуемыми веществами, найти – во сколько раз активатор или ингибитор стимулирует или тормозит действие амилазы.

При высокой активности амилазы слюны количество пробирок в опыте увеличивается до 7-8 штук.

 

 

Выявление активаторов и ингибиторов амилазы и определение степени на действия

Окраска проб с йодом после инкубации о присутствии:	Номера пробирок и доля слюны в содержимом, мл
	1	2	3	4	5	6
Разведение слюны	1:?
воды (контрольная проба)
хлорида натрия
сульфата меди (II)