Стандартный подсчет колоний

Сущность метода заключается в подсчете жизнеспособных микроорганизмов посевом на питательные среды, где микробные клетки в процессе деления образуют колонии видимые невооруженным глазом.

Метод стандартного подсчета колоний (СПК) предусматривает измельчение и гомогенизацию образ­ца пищевых продуктов, его растворение в растворителе. Затем конкретное количество гомогената, разбавленного в растворителе высевают на агаровую среду (поверхностным или глубинным методами) и инкубируют при соответствующей температуре в течение определенного времени. Потом подсчитывают все видимые колонии с ис­пользованием счетчика колоний.

Количество обнаруживаемых микроорганизмов рассмотривается как функция факторов: систематическая группа микробиоты продукта; избранный метод исследования; история пищевого продукта до исследовния; состав плотных питательных сред; температура, время инкубирования; рН, влажность и окислительно-восстановительный потенциал плотных питательных сред; относительное количество микроорганизмов в образце; наличие других конкурентных или антагонистических организмов.

СПК чаще всего осуществляется глу­бинным посевом,однако нельзя исключать использование поверхностного посева, потому что результаты обоих методов вполне сравнимы. Растворенный методом серийных разведений образец в количестве 0,1, 0,5 или 1,0 мл наносятся на поверхность питательной среды. Затем с помощью изогнутого стеклянного или пластикового шпателя образец круговыми движениями равномерно распределяется по всей поверхности. При этом методе посева сохраняются чувствительные к высокой температуре психрофилы в пищевых продуктах, потому что микроорганизмы не по­падают в контакт с горячим расплавленным агаром. Для строгих аэробов предпочти­телен поверхностный посев, но микроаэрофильные организмы при таком посеве имеют тенденцию расти медленнее. При посеве на поверность агаровой пластинки необходимо равномерное растирание инокулята, чего трудно добиться на влажной поверхности. Избежать это неудобство можно кратковременным подсушиванием агаризированной среды в боксе.

СПИРАЛЬНЫЙ ПЛОТТЕР

Метод спирального плоттера (спирального посева) – это метод учета жизнеспособных микроорганизмов. Спиральный плоттер – это прибор, равномерно распределяющий тонкой струей суспензию гомогената по поверхности питательной среды в чашке Петри (рис..5.2.).

Рис.5.2. Спиральный плоттерEddyJet 2

 От центра пластины к ее краям, распределяя образец по архимедовой спирали, пере­мещается распределяющее устройство (рука), которое специальным прикрепленным шприцом отливает непрерывно уменьша­ющийся объем образца так, что концентрация в центре и у края достигает соот­ношения 10000:1. Инкубация посева в термостате показывает по количеству колоний на постоянную более высокую плотность вносимых микроорганизмов в центре пластины, в отличие от края.При посеве образца с помощью спирального плоттера выросшие колонии считают, используя так называемую сетку для подсчета (рис. 5.3.).

Рис.5.3. Сетка для подсчета колоний

Спиральный плоттер предпочтительней, так как экономится время исследования, питательная среда и лабораторная посуда.Приборв основном используют для исследованийтаких продуктов, какмолоко. Для использования плоттера разработали лазерный счетчик. Высокаястоимостьприборатребует его использованиедля анализа большого числа образцов. Метод описан в работе Сousin, M.A., J.M. Jay, and P.C. Vasavada (2001).

Метод спирального посева образцов является широко распространенной в микробиологии техникой, которая была разработана для сокращения количества чашек Петри с питательной средой, используемых для поверхностных посевов. Метод спирального посева позволяет не выполнять серийные разбавления образца, которые необходимы при традиционном способе посева, и которые отнимают много времени. Один спиральный посев позволяет сэкономить 3 чашки питательной среды, что существенно сокращает время операции и расход материалов.

Спиральный посев образцов проводится по так называемой Архимедовой спирали. Объем пробы, нанесенный вдоль спирали экспоненциально уменьшается так, что один посев содержит несколько концентраций образца, распределенных вдоль спирали. После инкубации, результат учитывают с помощью специальной учетной сетки (вручную) или автоматически с помощью автоматического счетчика колоний.

В приборе EddyJet 2 (производитель IUL) реализован новый подход который заключается в использовании для нанесения материала образца стерилизованных γ-радиацией одноразовых микрошприцов, что предотвращает перекрестную контаминацию. Использование стерильныхмикрошприцев делает ненужными этапы очистки, что позволяет сэкономить большое количество времени.

МЕМБРАННЫЕ ФИЛЬТРЫ

Мембраны с размером пор около 0,45 мкм позволяют при фильтрации растворенной пробы задержи­вать бактерии, но пропускать воду или растворитель. В результате фильтрации на фильтре накапливаются бактерииимембрану поме­щают на агаровую пластину, содержащую питательный субстрат, и термостатируют. Затем производят подсчет колоний.

Техника прямого флуоресцентногофильтрования.     Подготовленный образец продукта фильтруют, используя фильтр с порами диаметром 5мкм. Фильтрат обрабатывают тритона и трипсином для растворения соматических клеток. Затем фильтраты термостатируют и фильтруют через мембраны 0,6 мкм.Фильтрат окрашивают флуорохромами. В высушенных мазочкахподсчитываютклетки с по­мощью люминесцентногомикроскопа.Метод по­зволяет определять от 6 000 КОЕ/г в мясных и молочных продуктах.