Периодическое культивирование.

Периодическим (стационарным) называют такой метод культивирования, когда клетки микроорганизмов вносят в питательную среду и далее компоненты среды не поступают в сосуд и не удаляются из него.

Периодическое культивирование микроорганизмов представляет с точки зрения техники наиболее простой метод культивирования. Под культивированием микроорганизмов понимают их выращивание в наиболее благоприятных (оптимальных) условиях.

При периодическом способе культивирования питательная среда засевается исходной культурой продуцента - инокулятом (от лат. inoculatio – прививка). Инокулят иначе называют посевным материалом, а инокуляцию называют посевом. Далее в этой же емкости микроорганизмы при определенных условиях проходят через все стадии роста и развития популяции. При таком способе культивирования (его можно назвать «закрытой» системой, когда хотя бы один из компонентов не может поступать в нее или выводиться из нее) скорость роста биомассы всегда должна стремиться к нулю либо из-за недостатка питательных веществ, либо из-за накопления в среде токсических метаболитов. Поскольку при периодическом способе культивирования микроорганизма всегда имеет место некоторая неустойчивость в системе.

В простой гомогенной периодической культуре все ее части находятся в одинаковых условиях. Для феноменологического описания роста микроорганизмов в периодическом режиме обычно используют кривую роста (рис. 21). Она имеет S-образный характер. Различные фазы роста такой культуры отражают изменения в биомассе и в окружающей среде. Продолжительность каждого периода зависит от вида культуры, количества и качества посевного материала, состава питательной среды и условий культивирования.

Периодическая культура начинается с лаг - фазы, которая является совершенно необязательной фазой роста. Ее возникновение зависит от несоблюдения оптимальных условий для роста посевного материала. Происходит перепад концентраций элементов питания, особенно углеродного, от сниженных – в выросшей культуре, из которой берется посевной материал, к высоким – в свежей среде. В этот период культура как бы адаптируется (привыкает) к новой среде обитания. Истощенные клетки старого посевного материала должны перейти из состояния голодания или отравления в состояние, соответствующее способности к размножению, которое определяется необходимым количеством и состоянием рибосом, способностью и условиями к репликации, синтезу клеточной стенки и т. п. Продолжительность этой фазы зависит от физиологических особенностей микроорганизма, состава посевной и производственной сред и условий культивирования. Чем эти различия меньше и чем больше посевная доза, тем короче I фаза роста.

Рисунок21. Фазы на кривой роста периодической культуры: I – лаг-фаза; II – фаза ускорения роста; III – фаза экспоненциального роста; IV – фаза замедления роста; V – стационарная фаза; VI – фаза отмирания.

II фаза называется фазой ускорения роста, она характеризуется началом деления клеток, увеличением общей массы популяции и постоянным увеличение скорости роста культуры; обычно она непродолжительна.

Далее следует экспоненциальная фаза, в наибольшей степени характеризующая и выражающая способность культуры к размножению. В этой фазе сведены к минимуму все лимитирующие и ингибирующие влияния. Компоненты питательной среды имеются в избытке, продукты обмена еще не накопились. Рост идет с максимально возможной скоростью, генетически заложенной в клетке, интервалы между появлением предыдущего и последующего поколений постоянны. Логарифм числа клеток линейно зависит от времени. Если же среда по своему начальному составу не оптимальна, то рост будет ограничен неподходящим питанием или неоптимальным значением рН и т. п. В этом случае рост может быть описан более пологой экспонентой или прямой. Эта фаза в лабораторных условиях не может быть длительной, так как даже не очень плотная популяция вскоре начнёт испытывать недостаток в кислороде из-за его быстрого поглощения и слабой растворимости.

Фаза замедления роста может быть очень разнообразной и самой сложной. Она может полностью отсутствовать на простых синтетических средах, когда рост сразу останавливается из-за отсутствия одного элемента питания, в особенности – источника углерода и энергии. Рост клеток прекращается, и наступает стационарная фаза, в данном случае – фаза голодания по использованному элементу питания. Возникает и пространственная ограниченность, клетки мешают друг другу, уменьшаются поверхности их контакта со средой, ухудшаются поступление питательных веществ внутрь клетки и выброс продуктов метаболизма. На сложных средах, содержащих несколько источников углерода, может происходить поочередная их утилизация и постепенное замедление роста. При избытке питания рост замедляется из-за накопления продуктов метаболизма. Токсичные продукты метаболизма у микроорганизмов весьма разнообразны. Возможно одновременное отравление и голодание. В соответствии с этим и стационарная фаза может содержать самые разнокачественные клетки: живые, но голодающие, живые, но ингибированные, отмирающие по причине голодания или отравления.

Стационарная фаза не характеризует культуру, так как в этот период состояние клеток может быть самым разнообразным. Масса и количество всех живых клеток во время этой фазы достигают своего максимума. Количество вновь образовавшихся клеток становится на этом этапе равным количеству клеток, отмерших и автолизовавшихся. В какой-то момент это равновесие нарушается, и количество отмерших клеток становится больше вновь образовавшихся, наступает VI фаза – фаза отмирания. На этой стадии масса живых клеток значительно уменьшается, так как запасные вещества клетки исчерпываются.

Только экспоненциальная фаза до некоторой степени характеризует свойства культуры.

Таким образом, клетки периодической культуры претерпевают значительные изменения всех свойств по всему периоду роста, обусловленные непрерывными изменениями окружающей среда и быстрой реакцией на них клеток. Тем не менее, периодические методы культивирования микроорганизмов широко используются в настоящее время в промышленной биотехнологии и исследовательской практике. Техника периодической культуры позволяет получить исходные данные, и расходные коэффициенты, и кинетические характеристики культуры, необходимые для перехода к проточным системам и масштабированию процесса.