Факторы, влияющие на получение вторичных метаболитов на основе культуры растительных клеток и тканей.

Занятие 10.

 

ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Получение различных классов веществ на основе культур растительных клеток и тканей.

 

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Рассмотреть основные направления и способы получения различных соединений, в том числе и лекарственных веществ на основе растительных культур.

 

Вопросы, выносимые на семинар:

 

1. Укажите проблемы, возникающие при культивировании растительных клеток и тканей. Рассмотрите основные пути их разрешения.

2. Перечислите и охарактеризуйте факторы, влияющие на процессы культивирования растительных клеток и тканей.

3. Укажите и охарактеризуйте основные методики производства лекарственных субстанций из растений.

4. Приведите характеристику соединений класса «простагландины»; особенности их получения.

5. Поясните химическую природу и функции шиконина. Рассмотрите технологию получения шиконина на основе культуры растительных тканей. Охарактеризуйте альтернативные пути получения шиконина.

6. Охарактеризуйте особенности процесса биотрансформации дигитоксина.

7. Поясните этапы получения гибридных клеток и охарактеризуйте перспективы развития данного направления клеточной инженерии.

8. Ведите понятие «клеточная ассоциация». Приведите примеры.

9. Охарактеризуйте значение и основные перспективы развития клеточной инженерии.

10. Перечислите и охарактеризуйте основные методы оценки активности препаратов на основе растительных тканей.

 

Задание 1: Изучить учебный материал.

 

Учебный материал.

 

Новый этап в развитии биотехнологии связан в первую очередь с использованием растительных клеток. На настоящий момент на основе растений получают около 25 % фармацевтических препаратов. Растения – это сырье для тонкой химии, а также источник биохимических компонентов для косметических изделий и пищевых добавок. Биотехнология стремится увеличить выход ценных продуктов растений, и при необходимости, специалисты изменяют их свойства, а также прививают им способность производить новые не свойственные для них виды продуктов.

Благодаря новейшим открытиям молекулярной биологии и генетики, а также достижениям в области генной инженерии растения стали быстро вовлекаться в сферу биотехнологии. Этому способствует ряд особенностей жизнедеятельности и размножения растений – способность к неограниченному вегетативному размножению, т.е. к регенерации полноценного растения из черенка, а в условиях биотехнологических систем – из небольшой группы клеток и даже из одной клетки. При культивировании на питательных средах растительные клетки способные в одних условиях неограниченно размножаться, быстро наращивая биомассу, а в других – дифференцироваться, образовывая корешки, стебельки, листочки (формируя в пробирке миниатюрное растеньице), а затем переходить к цветению и плодоношению.

Таким образом, весь свой биологический цикл растения могут осуществлять в неполовых, контролируемых условиях биологических систем.

Оказывая на развивающиеся в этих условиях растения физические, химические и иные воздействия, можно направленно улучшать культивируемые сорта, повышать их продуктивность, использовать растительные клетки в качестве биологически активных веществ.

Благодаря биотехнологии традиционные методы гибридизации растений расширились и стали проводиться на клеточном уровне. С помощью новых методов клеточной инженерии теперь сливают друг с другом клетки разных растений и получают из них новые гибридные растения. Новые методы чрезвычайно расширили границы спектра скрещиваемых растений, куда вошли не скрещивающиеся в природе виды. Однако техническая возможность соединений клеток очень отдаленных видов растений не всегда означает преодоление их биологической несовместимости, поэтому не все гибриды могут сохраняться.

 

1. Трудности культивирования растительных клеток.

 

Культивирование растительных клеток в крупных масштабах было освоено в 1976 г японскими исследователями, которым удалось получить биомассу в объеме 20 м³.

Как и в опытах с микроорганизмами, для экстракции полезных соединений из растительной биомассы клетки необходимо разрушить, но т.к. процесс накопления растительной биомассы значительно более дорог, чем процесс накопления бактерий или дрожжей, потому ученые стремятся избежать разрушения клеток.

Наиболее перспективным решением проблемы, как при реализации полного биосинтеза полезных соединений, так и для биологических превращений доступных веществ, представляется иммобилизация растительных клеток внутри пористых полимеров. В целях обеспечения рентабельности такой системы необходимо, чтобы такие иммобилизованные клетки оставались живыми в течение длительного времени (опыт показывает, что клетки могут оставаться живыми при иммобилизации в таких системах в течение нескольких сотен дней). Но в этом случае встает проблема извлечения из клеток, синтезированных вторичных метаболитов, которые обычно накапливаются в клеточных вакуолях и не выделяются в окружающую среду. По мнению многих специалистов, в настоящее время это основная проблема, осложняющая использование растительных клеток и тканей для производства полезных соединений.

Другая проблема связана со сложностью получения достаточных количеств гомогенного растительного материала и стабильных штаммов: для достижения этой цели требуются месяцы или даже годы напряженной работы в зависимости от особенностей используемого вида.

Кроме того, разнообразие биохимических реакций, наблюдаемое в культуре растительных клеток не всегда удается точно воспроизвести, следовательно, необходимо поддерживать коллекцию с большим количеством разнообразных штаммов, чтобы не утратить те из них, в которых синтезируется новое соединение.

Еще одна трудность заключается в обязательности использования высокоспецифичных методов скрининга, которые позволили бы точно идентифицировать все синтезируемые вещества, в том числе и новые соединения, присутствующие в незначительных количествах; это особенно важно для всех культур тропических растений, биохимия которых изучена слабо. Таким образом, специализированные коллекции штаммов обеспечили бы не только сохранение генофонда, но и способствовали бы открытию новых веществ, обладающих терапевтическим действием.

Знания и практический опыт, накопленные относительно иммобилизации бактериальных клеток и их ферментов, а также особенностей функционирования таких биореакторов, несомненно, внесут весомый вклад в развитие технологии, применяемой для культуры растительных клеток.

 

Факторы, влияющие на получение вторичных метаболитов на основе культуры растительных клеток и тканей.

Способность культур тканей к накоплению вторичных метаболитов – установленный факт. На образование вторичных метаболитов в культуре оказывают влияние следующие факторы:

- происхождение ткани;

- условия культивирования, т.е. применяемые питательные среды, способы выращивания, воздействие различных стрессовыхфакторов;

- клеточная дифференциация in vitro;

- селекция.

а) Происхождение ткани.

Для введения в культуру ткани проводят поиск наиболее продуктивных растений, в надежде, что эта способность будет перенесена и в получаемую культуру растительных тканей. Например, культуры тканей Catharanthus roseus, полученные из высокоалкалоидных растений, проявили тенденцию к синтезу большего количества алкалоидов, чем культуры, полученные из малопродуктивных растений.

Однако экспериментальные данные в этом вопросе довольно противоречивы.

б) Условия культивирования.

1. Особенности питания.

Важнейшим фактором создания эффективной биотехнологической системы является разработка питательной среды, обеспечивающей потребность продуцента в химических компонентах, необходимых для оптимального биосинтеза целевою продукта.

Культура ткани имеет гетеротрофный тип питания, источник углерода (сахароза) вводится в состав питательной среды в готовом виде (для усвоения). Получение автотрофных фотосинтезирующих культур растительных тканей является задачей будущего. В среде, где все питательные вещества присутствуют в избытке, увеличение концентрации сахарозы приводит к пропорциональному увеличению биомассы, кроме того, оказывает положительный эффект на выход действующих веществ.

Для многих растительных культур разработаны способы двухэтапного выращивания, т.е. в данном случае растительные ткани после накопления достаточного количества биомассы переносятся в продукционные среды, способствующие максимальному синтезу в биомассе биологически активных веществ. В таких средах содержится большое количество сахарозы (5 – 10 %), изменено соотношение аммиачной и нитратной форм азота, снижена концентрация фосфат-ионов, иногда из среды исключены фитогормоны и часть витаминов.

2. Стрессовые факторы.

Образование вторичных метаболитов в культуреткани может резко возрасти под влиянием стрессовых факторов, т.е. продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, осмотического шока, токсических ионов тяжелых металлов и т. д.

Вторичные метаболиты некоторых растений являются фитоалексинами, т.е. их синтез в растительной клетке происходит в ответ на действие продуктов жизнедеятельности микроорганизмов для защиты от фитопатогенов. При добавлении к культуре ткани элекситоров (гомогенат из грибного мицелия или другие продукты жизнедеятельности микроорганизмов) возрастает интенсивность синтеза некоторых ценных веществ. Кроме элекситоров грибного и микробного происхождения биосинтез вторичных метаболитов могут стимулировать и химические вещества, так, клетки Lithospermum erythrorhizon после переноса в продукционную среду, содержащую в 30 раз больше сульфата меди, чем ростовая среда, резко усилили синтез шиконина. По-видимому, высокая концентрация сульфата меди вызвала стресс, что индуцировало усиленное образование шиконина.

3. Способы выращивания.

При увеличении концентрации продукта в клетке выше пороговой, срабатывает эффект обратного ингибирования, вследствие чего дальнейшее накопление вещества прекращается. Это обуславливает низкое содержание искомых веществ в клетках культуры. Чтобы избежать этого эффекта, рядом исследователей предпринимались попытки удалять продукт реакции по мере его синтеза из клетки. Для увеличения проницаемости клеток Cinchona ledgeriana в культуре и ускорения выхода внутриклеточных алкалоидов пытались применить диметилсульфоксид (ДМСО), но он оказался непригодным для индукции выделения алкалоидов при биотехнологической эксплуатации Cinchona ledgeriana. Даже при высокой концентрации ДМСО высвобождение алкалоидов протекало медленно и большинство отработанных мембран не восстанавливалось.

Для некоторых суспензионных культур весьма экономичным оказался способ выращивания клеток в виде двухфазной системы, позволяющий повысить выход целевого продукта. Такая культура состоит из водной фазы (питательная среда с растущими клетками) и нетоксичной липофильной фазы (триглицериды или парафины). В результате липофильные вещества, синтезируемые клетками в процессе их роста, переходят в липофильную фазу. Например, корончатогалловая опухолевая суспензионная культура Matricaria chamomilla росла в двухфазной системе, состоящей из водного раствора питательной среды и нетоксичной липофильной фазы (триглицерид миглиол) в течение 22 дней. В результате жирорастворимого продукта, синтезируемые культурой ткани ромашки, накапливались в фазе миглиола в концентрации, в 60 раз большей, чем в однофазной системе.

Красящий продукт нафтохинон шиконин, продуцируемый суспензионной культурой Lithospermum erythrorhizon, не растворяется в воде, но растворяется в некоторых органических растворителях. Это свойство шиконина использовано при выращивании ткани в двухфазной культуре. В качестве органического растворителя был взят гексадекан, который растворил 81 % синтезируемого клетками шиконина. Причем культура прекращала синтез шиконина, если он из клеток не переходил в органический слой.

в) Клеточная дифференциация in vitro.

Образование и накопление вторичных продуктов в растениях – сложный, пространственно организованный процесс, который в той или иной степени включает в транспорт этих веществ на клеточном и субклеточном уровнях. В целом в ряде случаев показано, разграничение мест первичного синтеза и накопления алкалоидов. Эти два процесса могут быть локализованы в пределах одно и того же органа или даже одной и той же ткани, но в различных клетках, что говорит об эпигенетическом контроле процесса пространственного разобщения синтеза и накопления конечного продукта. Например, люпиновые алкалоиды синтезируются в зеленых частях растений, а накапливаются в корнях.

В культурах тканей растений, также как и в растениях, накопление вторичных метаболитов зачастую тесно связано со степенью тканевой дифференциации. В культурах ткани обычно формируются секреторные канальцы, млечники, слизевые клетки, железки или специализированные клетки, где накапливаются конечные продукты, т.е. наблюдается процесс разобщения синтеза и накопления вторичных веществ.

Например, практически все клетки в каллусе Macleaya microcarpa обладают способностью синтезировать изохиноновые алкалоиды, но их накопление осуществляется лишь в специализированных «алкалоидных» клетках.

Исследователи, работающие с культурой ткани, неоднократно наблюдали, что при образовании в каллусной ткани морфологических структур (побегов, корней, эмбриоидов и т.п.) содержание продуктов в культуре увеличивается. Например, культура ткани Atropa belladonna при недифференцированном росте не продуцировали гиосциамин, а при образовании корней в каллусе, начинается синтез алкалоидов.

Индукция морфогенеза в культуре ткани Papaver bracteatum привела к появлению алкалоидов тебаина и морфина, тогда как в недифференцированных каллусных тканях накапливались сангвинарин и допамин.

Интерес представляют цитодифференцировки, происходящие в тканях Catharantus roseus при переносе их из «ростовой» среды в «продукционную» среду. В цитоплазме паренхимных клеток при выращивании их в течение двух недель на «алкалоидпродуцирующей» среде появились большие липидные капли, что коррелировало с накоплением алкалоидов.

г) Селекция.

Промышленное применение культур тканей в качестве лекарственных средств предполагает использование высокопродуктивных и стабильных клонов. Культивирование клеток in vitro может сопровождаться значительным генетическим разнообразием, т.е. сомаклональная изменчивость, возникающая при длительном культивировании каллуса. Сомаклональные вариации могут затрагивать хозяйственно ценные признаки. На изменчивости клеток в культуре in vitro основана селекция штаммов, обеспечивающая больший выход ценных продуктов метаболизма растительной клетки.

Так, при клонировании суспензионной культуры клеток паслена выделили линии, накапливающие более 3 % соланидина.

Успех в селекции в значительной мере зависит от внедрения методов количественной оценки селекционного материала. Вопросы быстрого и несложного определения алкалоидов в растительном сырье для селекционных целей неоднократно привлекали к себе внимание исследователей. Так, высокопродуктивные клоны культуры ткани табака были отселектированы благодаря полуколичественному методу определения алкалоидов с применением реактива Драгендорфа. Ярко-голубая флуоресценция серпентина в УФ-свете была использована в селекции высокоалкалоидных штаммов суспензионной культуры Catharantus roseus.

Для количественной оценки содержания аймалина в культуре ткани Rauwolfia serpentina разработан быстрый и несложный экспресс-метод, основанный на сравнении интенсивности окраски пятен сока каллусных культур, нанесенных на фильтровальную бумагу и обработанных цветным реактивом, со шкалой стандартов. Метод позволяет исключить заведомо неперспективные варианты и сократить количество культур, подлежащих окончательной проверке.

В 70-х гг. для анализа алкалоидов был применен радиоиммунологический анализ, а позднее иммуноферментный метод диагностики, что позволило значительно повысить эффективность отбора.

Опыт селекционной работы с культурами тканей продуцентов свидетельствует о том, что при использовании мутагенов, селективных сред и высокоэффективных методов отбора возможен успех в селекции штаммов. После воздействия мутагена этиленимина на клетки Rauwolfia serpentina была выделена клеточная линия, отличающаяся повышенным содержанием аймалина.

Успешной оказалась селекция, основанная на отборе окрашенных участков культуры ткани. Окраска тканей растений является наследственным признаком, связанным с их химическим составом. Связь между окраской тканей и их химическим составом была использована в селекции высокопродуктивных по содержанию антрацианидов культур тканей моркови. После 12 пассажей содержание антрацианидов увеличилось в 3 раза.

Важным условием биотехнологического использования культур тканей является их стабильность, гарантирующая стандартность лекарственного растительного сырья. Но для многих культур тканей, например, Catharantus roseus, единственным путем сохранения высокой продуктивности является регулярный поддерживающей отбор, их нестабильность – серьезное препятствие к промышленному использованию.

Таким образом, селекция в культуре ткани проводится различными методами, которые по своим принципами их можно разделить на следующие группы:

- непосредственный отбор форм, оказавшихся практически ценными;

- селекция колоний определенного морфологического типа;

- селекция мутантов, устойчивых к токсическим предшественникам или конечным продуктам;

- выделение ауксотрофных мутантов;

- получение мутантов устойчивых к аналогам аминокислот или азотистых оснований;

- получение штаммов путем обработки клеток химическими веществами, индуцирующими высокую плоидность;

- селекция устойчивых рекомбинантных штаммов и др.

Основой биотехнологического использования культур тканей растений является способность клеток in vitro синтезировать самые разнообразные группы веществ: многочисленные фенольные соединения, гликозиды, эфирные масла, каротиноиды, алкалоиды и другие соединения. Все вышеперечисленные вещества участвуют в обмене веществ в «организме» растений и выполняют определенные и часто весьма существенные функции.

В некоторых случаях культуры клеток и тканей вместо ожидаемых продуктов накапливают близкие по биогенезу вещества, являющиеся биогенетическими предшественниками, которые в результате химического или ферментативного синтеза можно легко превратить в желаемый продукт, подобно тому, как из стероидных соединений растительного происхождения синтезируют гормоны.