Специальные методы световой микроскопии

Темнопольная микроскопия (микроскопия в темном поле) основана на использовании специального конденсора, обеспечивающего освещение препарата косыми лучами, не попадающими в объектив. В отсутствие объектов поле зрения представляется темным. При их наличии часть света отражается ими в объектив, в результате чего их изображение обнаруживается в окуляре. Метод позволяет выявить структуры, размеры которых лежат за пределами разрешения светового микроскопа. Он может использоваться для изучения живых клеток.

Фазово-контрастная микроскопия основана на неодинаковом изменении фазы световых лучей при их прохождении через различные структуры изучаемого объекта. Фазово-контрастный микроскоп преобразует незаметные для человеческого глаза фазовые различия в амплитудные. Этот метод дает возможность непосредственного изучения живых клеток без их фиксации и окрашивания.

Поляризационная микроскопия используется для изучения структур, обладающих свойствами анизотропии или двойного лучепреломления. В поляризационном микроскопе на объект направляется поляризованный пучок света, который в дальнейшем пропускается через анализатор (расположенный между объективом и окуляром) – устройство, определяющее отклонения плоскости поляризации света вследствие его прохождения через объект. Тем самым выявляется закономерное пространственное расположение молекул в объекте.

Ультрафиолетовая микроскопия связана с освещением изучаемого объекта ультрафиолетовыми лучами, которые избирательно поглощаются его структурными компонентами. Благодаря тому, что ультрафиолетовые лучи имеют более короткую длину волны по сравнению с лучами видимой части спектра, разрешающая способность микроскопа повышается примерно вдвое. Невидимое изображение в ультрафиолетовом микроскопе преобразуется в видимое с помощью люминесцентного экрана или других устройств.

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия использует способность некоторых веществ излучать видимый свет при освещении объекта ультрафиолетовыми лучами (аутофлюоресценция). В некоторых случаях (например, при выявлении катехоламинов методом Фалька) флюоресценция возникает после предварительной химической обработки ткани. Применяют также флуоресцентные красители (флюорохромы), связывающиеся с различными структурами или веществами в клетках и межклеточном веществе. Так, акридиновый оранжевый, связываясь с ДНК, дает свечение желто-зеленого цвета, а с РНК – красно-оранжевого. Флюоресцентные красители связывают (конъюгируют) со специфическими антителами для выявления соответствующих антигенов в тканях иммуно-гистохимическими методами.

Электронная микроскопия

В настоящее время в научных исследованиях и клинической диагностике широкое применение нашли два метода электронной микроскопии – трансмиссионная (просвечивающая) электронная микроскопия и сканирующая (растровая) электронная микроскопия, использующие соответствующие микроскопы – ТЭМ (ПЭМ) и СЭМ (РЭМ).

Трансмиссионная (просвечивающая) электронная микроскопия основана на использовании пучка электронов, излучаемого электронной пушкой внутри колонны микроскопа в условиях высокого ускоряющего напряжения (40–100 кВ) и глубокого вакуума (10^{-4 мм рт. ст.). Фокусировка пучка осуществляется электромагнитными линзами, играющими роль конденсора, объектива и проектора. После прохождения через изучаемый объект, помещенный в колонну и обладающий в различных своих участках неравномерной электронной плотностью, пучок электронов направляется на флюоресцирующий экран и создает плоскостное изображение объекта, которое фотографируется на пластинку или пленку (рис. 76).}

ТЭМ дает возможность изучения объектов, размеры которых лежат как в пределах разрешения светового микроскопа, так и далеко за ними (вплоть до уровня макромолекул). Его разрешение теоретически достигает 0,002 нм, однако практически составляет 0,2–0,5 нм, а для большинства биологических объектов – 1–2 нм. Увеличение ТЭМ равно 100–1500 тыс. раз.

Высоковольтный ТЭМ (с ускоряющим напряжением до 1000 кВ) обеспечивает более высокую скорость движения электронов, которые глубже проникают в объект. Этот микроскоп дает очень высокое разрешение и позволяет использовать более толстые срезы (до нескольких микро-метров).