Структура бактериальной клетки(ЦПМ, цитоплазма, нуклеоид, рибосомы, включения) Микроскопические методы выявления.

Структуру бактерий изучают с помощью электронной микроскопии целых клеток и их ультратонких срезов. Основными структурами бактериальной клетки являются: клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, цитоплазма с включениями и ядро, называемое нуклеоидом. Бактерии могут иметь и дополнительные структуры: капсулу, микрокапсулу, слизь, жгутики, фимбрии, пили; некоторые бактерии способны образовывать споры.Клеточная стенка — прочная, упругая структура, придающая бактерии определенную форму и сдерживающая высокое осмотическое давление в клетке. Она участвует в процессе деления клетки и транспорте метаболитов. У грамположительных бактерий клеточная стенка толще, чем у грамотрицательных, достигая 50 нм и более. В клеточной стенке грамположительных бактерий содержится небольшое количество полисахаридов, липидов и белков. Большую часть массы (40—90 %) клеточной стенки этих бактерий составляет пептидогликан (синонимы: муреин, мукопептид), ковалентно связанный с тейхоевыми кислотами (от греч. teichos — стенка). В клеточной стенке грамотрицательных бактерий пептидогликана содержится меньше (5—10 %). Способность грамположигельных бактерий при окраске по Грачу удерживать генциановый фиолетовый в комплексе с йодом (сине-фиолетовая окраска бактерий) связана со свойством многослойного пептидогликана взаимодействовать с краской. Обработка окрашенного по Граму мазка бактерий спиртом вызывает сужение пор в пептидогликане и тем самым задерживает краску в клеточной стенке. Наоборот, грамотрииательныс бактерии после воздействия спиртом утрачивают краситель, обесцвечиваются и при обработке фуксином окрашиваются в красный цвет вследствие меньшего содержания пептидогликана (5—10 % массы клеточной стенки).Цитоплазматическая мембрана является трехслойной структурой и окружает наружную часть цитоплазмы бактерий. По структуре она похожа на цитоплазматическую мембрану клеток животных; состоит из двойного слоя липидов, главным образом фосфолипидов со встроенными поверхностными и интегральными белками, как бы пронизывающими насквозь структуру мембраны. Некоторые из них являются пермеазами, участвующими в транспорте веществ. Цитоплазматическая мембрана является динамической структурой с подвижными компонентами, поэтому ее представляют как мобильную, текучую структуру. Она участвует в регуляции осмотического давления, транспорте веществ и энергетическом метаболизме клетки (за счет ферментов цепи переноса электронов, АТФ-азы и др.).Цитоплазма бактерии занимает основной объем клетки и состоит из растворимых белков. Рибосомы бактерий имеют коэффициент седиментации 70 S в отличие от рибосом, характерных для эукариотических клеток (80 S). Поэтому некоторые антибиотики, действие которых основано на подавлении синтеза белка путем связывания их с рибосомами бактерий, не оказывают влияния на синтез белка эукариотических клеток. В цитоплазме имеются различные включения — полисахариды, поли-β-масляная кислота и полифосфаты (волютинпо Нейсеру). Они накапливаются при избытке питательных веществ в окружающей среде и выполняют роль запасных веществ для питания и энергетических потребностей. Зерна волютина выявляются у дифтерийной палочки в виде интенсивно прокрашивающихся полюсов клетки. Нуклеоид (образование, подобное чару) — эквивалент ядра у бактерий. Нуклеоид расположен в центральной зоне бактерий в виде двунитчатой ДНК, замкнутой в кольцо и плотно уложенной наподобие клубка. В отличие от эукариот ядро бактерий не имеет ядерной оболочки, ядрышка и основных белков (гистонов). Обычно в бактериальной клетке содержится одна хромосома, представленная замкнутой в кольцо молекулой ДНК. При нарушении деления в ней может находиться 4 хромосомы и более.Нуклеоид выявляется в световом микроскопе после окраски специфическими для ДНК методами по Фельгену или Гимзе. На электронограммах ультратонких срезов бактерий нуклеоид имеет вид светлых зон с фибриллярными, нитевидными структурами ДНК.

Микроскопические методы исследования основаны на обнаружении и исследовании возбудителя в биологическом материале. Используют светооптическую и электронную микроскопию. Светооптическая микроскопия позволяет изучать объекты размером более 0,2 мкм (бактерии, простейшие, грибы и др.), электронная микроскопия — более мелкие объекты (вирусы, отдельные структуры микроорганизмов).

Микроскопический метод широко применяют в диагностике инфекционных болезней бактериальной этиологии, паразитарных и (реже) вирусных заболеваний.

Материалом для микроскопического исследования могут служить кровь, костный мозг, СМЖ, пунктаты лимфатических узлов, фекалии, дуоденальное содержимое и жёлчь, моча, мокрота, отделяемое мочеполовых путей, биоптаты тканей, мазки со слизистых оболочек (ротовой полости, нёбных миндалин, носа, влагалища и др.).

Для световой микроскопии и основанных на ней других М.м.и. определяющее значение помимо разрешающей способности Микроскопаимеет характер и направленность светового луча, а также особенности изучаемого объекта, который может быть прозрачным и непрозрачным. В зависимости от свойств объекта изменяются физические свойства света — его цвет и яркость, связанные с длиной и амплитудой волны, фаза, плоскость и направление распространения волны. На использовании этих свойств света и строятся различные М.м.и. Для световой микроскопии биологические объекты обычно окрашивают с целью выявления тех или иных их свойств. При этом ткани должны быть фиксированы, т.к. окраска выявляет определенные структуры только убитых клеток. В живой клетке краситель обособляется в цитоплазме в виде вакуоли и не прокрашивает ее структуры. Однако в световом микроскопе можно изучать и живые биологические объекты с помощью метода витальной микроскопии. В этом случае применяют темнопольный конденсор, который встраивают в микроскоп.

Для исследования живых и неокрашенных биологических объектов используют также фазово-контрастную микроскопию. Она основана на дифракции луча света в зависимости от особенностей объекта излучения. Разновидностью фазово-контрастной микроскопии является амплитудно-контрастная, или аноптральная, микроскопия, при которой применяют объектив со специальными пластинками, изменяющими только яркость и цвет фонового света. Фазово-контрастная микроскопия находит применение в микробиологии и паразитологии при исследовании микроорганизмов, простейших, клеток растений и животных; в гематологии для подсчета и определения дифференцировки клеток костного мозга и крови; а также при изучении клеток культуры тканей и т.п.

Интерференционная микроскопия решает те же задачи, что и фазово-контрастная. Но если последняя позволяет наблюдать лишь контуры объектов исследования, то с помощью интерференционной микроскопии можно изучать детали прозрачного объекта и проводить их количественный анализ. На основании данных интерференционной микроскопии можно косвенно судить о проницаемости мембран, активности ферментов, клеточном метаболизме объектов исследования.

Поляризационная микроскопия позволяет изучать объекты исследования в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимноперпендикулярных плоскостях, т.е. в поляризованном свете.

Морфология бактерий: актеномицетов, спирохет, риккетсий, микоплазм. Методы окрашивания. Примеры, названия бактерии на латинским языке. Роль в патологии человека.

Риккетсий — мелкие грамотрицательные палочковидные бактерии размером 0,35—1 мкм; облигатные внутриклеточные

паразиты. Обитают в организме членистоногих, которые являются их хозяевами или переносчиками. Форма и размер риккетсий могут меняться (клетки неправильной формы, нитевидные) в зависимости от условий роста. Риккетсий, как и большинство бактерий, размножаются бинарным делением. Структура риккетсий не отличается от таковой

грамотрицательных бактерий. Риккетсий обладают независимым от клетки-хозяина метаболизмом, однако, возможно, они получают от него макроэргические соединения для размножения. В мазках и тканях их окрашивают по методу Романовского—Гимзы или по П. Ф. Здродовскому(рекитсии окрашиваются в красный цвет, цитоплазма клеток, в которых они паразитируют, -в голубой, ядра – в синий. У человека риккетсии вызывают эпидемический сыпной тиф (Rickettsia prowazekii), клещевой риккетсиоз (R. sibirica), лихорадку цуцугамуши (R. tsutsugamushi), пятнистую лихорадку Скалистых гор (R. rickettsii) и др

Спирохеты (семейство Spirochaetaceae [от греч. speira. спираль, + chaite, волос]) относят к отделу Gracilicutes порядка Spirochaetates.

Спирохеты — тонкие, подвижные, спирально загштыс бактерии длиной 3-500 мкм. В мазках располагаются одиночно либо образуют цепочки, объединённые внешней оболочкой.

Клетки спирохет состоят из пpoтоплазатического цилиндра, переплетённого с одной или более осевыми фибриллами, отходящими от субтерминальных прикрепительных дисков, расположенных на обоих концах цилиндра (что сближает их с простейшими).

Медицинское значение среди спирохет имеют представители родов Treponema, Borrelia и Leptospira. Бактерии различных родов существенно различаются по тинкториальным свойствам; некоторые хорошо окрашиваются анилиновыми красителями (например, Borrelia recurrmtis) другие требуют специальных методов окраски.

Семейство Rickettsiaceae отдела Gracilicutes образуют небольшие аэробные полиморфные бактерии. Своё название риккетсии получили в честь американского бактериолога X. Риккетса, погибшего при изучении возбудителя сыпного тифа.

Патогенные для человека виды риккетсий входят в состав родов Rickettsia, Rochalimaea и Coxiella. Вызываемые риккетсиями заболевания известны как риккетсиозы; среди них выделяют группы тифов и пятнистых лихорадок, лихорадку цуцугамуши, Ку-лихорадку и траншейную лихорадку.

Естественный резервуар риккетсий — различные членистоногие. У этих животных риккетсии обитают в стенке кишечника, не нанося видимого вреда хозяевам.

Из стенки кишечника риккетсии могут проникать в репродуктивные органы и передаваться трансовариально дочерним поколениям. При попадании в организм «неестественного хозяина» (например, человека) риккетсии могут вызвать заболевание.

Заражение человека риккетсиями в большинстве случаев происходит через укусы членистоногих-переносчиков. Их биологическая принадлежность (клещи, вши, блохи) положена в основу разделения риккетсий на группы.

Длительное время актиномицеты считали грибами, однако изучение морфологии и биологических свойств позволило отнести их к бактериям семейства Actinomycetaceae отдела Firmicutes.

• В отличие от грибов, актиномицеты не содержат в клеточной стенке хитина или целлюлозы; они не способны к фотосинтезу, а образуемый ими мицелий достаточно примитивен. Также они резистентны к противогрибковым средствам.

• С бактериями актиномицеты объединяют отсутствие чётко выраженного ядра, сходство строения клеточной стенки, а также чувствительность к бактериофагам и антибиотикам. Для их роста также оптимальны слабощелочные, но не кислые значения рН среды.

Большинство актиномицетов — обитатели поверхности слизистых оболочек у млекопитающих; некоторые виды — почвенные сапрофиты. У человекаактиномицеты колонизируют слизистые оболочки полости рта и ЖКТ. Способность вызывать специфические поражения выражена сравнительно слабо. В соответствии с этим их следует рассматривать как условно-патогенные микроорганизмы.

Бактерии вызывают актиномикозы — хронические гнойные гранулематозные поражения различных органов. Впервые актиномикозы крупного рогатого скота детально изучил О. Боллингер (1877). Первое описание поражений у человека привёл Д. Израэль (1878).

Актиномицеты представлены тонкими, прямыми или слегка изогнутыми палочками размером 0,2-1,0x2,5 мкм, но часто образуют нити длиной до 10-50 мкм. Характерная особенность актиномицетов — способность образовывать хорошо развитый мицелий. Палочковидные формы часто имеют утолщённые концы, в мазках располагаются одиночно, парами, V- или Y-образно. Окраску по Граму фиксируют плохо; часто образуют зернистые либо чёткообраз-ные формы. Кислотонеустойчивы. Факультативные анаэробы; для хорошего роста нуждаются в повышенном содержании С02. Актиномикозы у людей отмечают редко; подавляющее большинство случаев вызывает A. israelii, лишь в редких случаях выделяют A. naeslundii, A. odontolyticus, A. bovis и A. viscosus.

Микоплазмы — мелкие прокариоты, лишённые истинной клеточной стенки и не способные синтезировать её компоненты. Функции клеточной стенкиу микоплазм выполняет трёхслойная ЦПМ.

Поэтому микоплазмы относят к отделу Tenericuies (буквально «нежнокожие») семейства Mycoplasmataceae класса Mollicutes (буквально «мягкокожие»), объединяющего микоплазмы, ахолеплазмы, спиронлазмы, анаэроплазмы и уреаплазмы.

Микоплазмы отличает полиморфизм, обусловленный отсутствием ригидной клеточной стенки. Микоплазмы образуют кокковидные, ветвящиеся, крупные многоядерные формы, а также псевдомицелий, обусловливающий их название [от греч. mykes, гриб, + plasma, нечто имеющее форму].

Микоплазмы размножаются бинарным делением, подобно большинству бактерий, особенно после образования мелких кокковидных образований (элементарные тельца, ЭТ) в нитевидных структурах.

Микоплазмы способны к почкованию и сегментации. Минимальной репродуцирующейся единицей считают ЭТ (0,7-0,2 мкм). Основной компонент клеточной мембраны — холестерин.

Микоплазмы не способны к образованию холестерина и утилизируют его из тканей или питательных сред, дополненных их внесением. По Граму окрашиваются отрицательно, но лучшие результаты даёт окраска по Романовскому-Гимзе.

Микоплазмы требовательны к условиям культивирования: в питательные среды необходимо вносить нативную сыворотку, холестерин, нуклеиновые кислоты, углеводы, витамины и различные соли. На плотных средах образуют характерные мелкие полупрозрачные колонии с приподнятым зернистым центром, придающим им вид «яичницы-глазуньи».

На средах с кровью некоторые виды микоплазм дают а- и бета-гемолиз. В полужидких средах микоплазмы растут по линии укола, формируя дисперсные, крош-коватые колонии. В жидких средах приводят к незначительному помутнению или опалесценции; некоторые штаммы способны образовывать тончайшую жирную плёнку.

У человека выделяют представителей родов Mycoplasma, Ureaplasma и Acholeplasma, включающих патогенные и сапрофитические виды.

Химический состав бактериальной клетки. Дыхание бактерий, классификация бактерии по типу дыхания. Ферменты МО. Особенности культивирования облигатных анаэробов.

По хим.составу больших отличий между прокариотами и эукариотами нет. В состав бакт.кл-ки входят:

1.биогенные хим.элементы. На их долю приходится 95% сухого остатка. Это С- 50%, О – 20%, N – 15%, Н – 10%.

2.макроэлементы. около 5%.Это Са,Na,Mg,K,Cl,P,S.

3.микроэлементы.приходятся доли%. Это Fe,Cu,I,Co и др.

Они входят в состав воды, белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, нейтрал.жиров. Их синтез контролируется генами.

Многие вещ-ва клетка получает извне, а другие – из организма хозяина.

В состав бакт.клетки входит вода 70-90% биомассы. Больше воды в капс.МО, меньше – у споровых МО.

Белки встречаются во всех структурных элементах клетки.В состав белков входят как обычные для эукариотов аминокислоты, так и входят оригинальные – Д-аланин, Д-глутамин, диаминопимилиновая кислота и др. Они входят в состав капсул и пептидогликана. Жгутики имеют белок плагелин, а пили – белок пилин.

Липиды. В основном это фосфолипиды. Они есть в ЦМ и в наружной мембране грамм»-» бактерий. Есть МО(возбудитель туберкулеза), которые содержат в клеточной стенке большое количество липидов до 40% сухого остатка. Это делает такие МО устойчивыми к кислотам, спиртам, щелочам.

Углеводы. Чаще встречаются в виде полисахаридов. Входят в состав капсул и клеточной стенки грамм «-» бактерий(ЛПС).

НК. Бактерии содержат ДНК и РНК. РНК находится в рибосомах – 80-85%. Есть т-РНК – 10% и м-РНК – 1-2% - в основном в одноцепочной форме. ДНК находится в ядерном аппарате(это хромосом.ДНК) или в цитоплазме – в плазмидах (это плазмидное ДНК). МО отличаются по структуре НК и содержанию азаотистых оснований. Генетический код состоит из 4 букв(А.Т.Г.Ц)

Дыхание, или биологическое окисление, основано на окислительно-восстановительных реакциях, идущих с образованием АТФ-универсального аккумулятора химической энергии. Энергия необходима микробной клетке для ее жизнедеятельности. При дыхании происходят процессы окисления и восстановления: окисление — отдача донорами (молекулами или атомами) водорода или электронов; восстановление — присоединение водорода или электронов к акцептору. Акцептором водорода или

электронов может быть молекулярный кислород (такое дыхание называется аэробным) или нитрат, сульфат, фумарат (такое дыхание называется анаэробным — нитратным, сульфатным, фумаратным).

По отношению к молекулярному кислороду бактерии можно разделить на три основные группы: облигатные, т.е. обязательные аэробы, облигатные анаэробы и факультативные анаэробы. Облигатные аэробы могут расти только при наличии кислорода. Облигатные анаэробы (клостридии ботулизма, газовой гангрены, столбняка, бактероиды и др.) растут только на среде без кислорода, который для них токсичен. Факультативные анаэробы могут расти как при наличии, так и при отсутствии кислорода, поскольку они способны переключаться с дыхания в присутствии молекулярного кислорода на брожение в его отсутствие. Факультативные анаэробы способны осуществлять анаэробное дыхание, называемое нитратным: нитрат, являющийся акцептором водорода, восстанавливается до молекулярного азота и аммиака

Ферменты

В состав бакт.клетки входят специфические белковые катализаторы – ферменты, которые синтезируют МО.

У МО есть ферменты 6 основных классов, которые есть и у людей: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, лигазы, изомеразы.

В соответствии с механизмами генетического контроля у МО выделяют 3 группы ферментов:

1.Конститутивные, синтез которых происходит постоянно

2.Индуцибельные, синтез которых индуц-ся наличием субстрата

3.Репресибельные, синтез которых подавляется избытком продуктов реакции

МО вырабатывают эндоферменты. Они есть у всех МО и вырабатываются во внутрь клетки, а при ее гибели – в организм человека.

Экзоферменты. Их вырабатывают только микробы-патогены(во внешн.среду). Болезни, вызванные микробами-патогенами, продуцирующими экзотоксины - токсигенные (холера, дифтерия, столбняк, ботулизм, идр.)

В зависимости от «точки приложения» экзотоксины делятся на: гуалуронидаза, лецитиназа, ДНК-аза и др. Они являюся ферментами патогенности и они помогают МО проникать через слизистые, тканные и другие барьеры; они облегчают преодоление слоя слизи и распространение МО в межклет.пространстве.

В практике баклабароторий пользуются микробиологической (рабочей) схемой классификация ферментов, основанных на биохимических свойствах МО и продуктах ферментирования сахаров, белков, это:

1.сахаролитическая

2.протеолитическая

3.аутолитическая

4.окислительно-восстановительная

5.ферменты патогенности

Ферменты находятся в лизосомах и ЦМ. Ферментный состав клетки определяется геномом и является постоянным признаком, что используется для диагностики.

Для культивирования анаэробных микроорганизмов необходимо создание бескислородных условий, достигаемое различными методами.
Физические методы основаны на создании вакуума в специальных аппаратах — анаэростатах. Иногда воздух в них заменяют каким-либо другим газом, например СО2. Доступ кислорода в питательную среду можно затруднить, если культивировать анаэробов в глубине столбика сахарного агара или среды Вильсона — Блера, налитых в пробирки в расплавленном состоянии и остуженных до 43°С. По методу Вейона — Виньяля расплавленный и остуженный агар с посевным материалом набирают в стеклянные трубочки, которые запаивают с двух концов.

Химические методы заключаются в том, что при культивировании исследуемого материала на плотных средах в эксикатор помещают химические вещества, например пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода. В жидкие питательные среды можно добавлять различные редуцирующие вещества: аскорбиновую или тиогликолевую кислоту.

Биологический метод основан на одновременном культивировании аэробов и анаэробов на плотных питательных средах в чашках Петри, герметически закупоренных. Вначале кислород поглощается растущими аэробами, посеянными на одной половине среды, а затем начинается рост анаэробов, посев которых сделан на другой половине. Наиболее удобна для культивирования анаэробов специальная среда Китта — Тароцци. В нее входят сахарный МПБ, который наливают в пробирки в количестве 10—12 мл, и кусочки вареных паренхиматозных органов. Перед употреблением среду Китта,— Тароцци кипятят на водяной бане для удаления растворенного в ней кислорода. Среду заливают сверху стерильным вазелиновым маслом. Заметный рост анаэробов (помутнение) может наблюдаться через 48 ч и более в зависимости от количества посевного материала.

Рост изолированных колоний анаэробов можно получить при рассеве исследуемого материала по поверхности кровяно-сахарного агара, разлитого в чашки Петри. После посева чашки помещают в анаэростат. Исследуемый материал в убывающей концентрации можно засевать в высокий столбик агара. Образовавшиеся отдельные колонии анаэробов выделяют, распилив пробирку в месте роста. Колонии анаэробов для получения значительного количества биомассы отсевают затем на среду Китта — Тароцци. В качестве источника энергии для анаэробов используют глюкозу, добавление которой в питательную среду обязательно.