Микроклональное размножение как способ ускоренного размножения и оздоровления декоративных культур

Модуль 1.

Лекция 1.5.

Для современной селекции, ботаники, интродукции растений чрезвычайно важным является сохранение существующего генофонда растений и выделение новых форм и сортов.

Хранение семян может обеспечить сохранение генофонда для некоторых культурных растений, но данный метод не может быть применен для сохранения видов, чьи семена быстро теряют всхожесть или, как махровые сорта сирени, неспособных образовывать семена.

Бутенко Р.Г. (1979) выделено три главных направления практического использования метода микроклонального размножения: 1) генетико-селекционные работы, культура зародышей, культура семяпочек, завязей, микроспор и пыльников; 2) быстрое микроклональное размножение растений; 3) освобождение посадочного материала от вирусной и другой инфекции.

Культура клеточных тканей и клеток может способствовать созданию лучших сортов, более быстрому использованию ценного материала и уникальных форм. Задачи, решаемые методом культуры тканей в селекции, группируют в три взаимно связанные группы: 1) расширение генетической базы селекции растений путем получения нового исходного материала; 2) сохранение и размножение ценных элитных растений и линий; 3) получение и сохранение безвирусного материала растений.

Обычные методы селекции, основанные на внутривидовой гибридизации и отборе, как правило, ведут к обеднению генетической изменчивости и сужению генетической базы, что влечет за собой потерю устойчивости создаваемых генотипов и их популяций.

Сохранение и размножение in vitro ценных элитных растений и линий применяется с целью получения генетически однородных клонов. При этом обеспечиваются: сохранение и размножение отдельных генотипов как исходных форм для решения специфических селекционных задач; быстрое эффективное размножение новых ценных сортов; сохранение и эффективное размножение линий для производства гибридных семян растений; экономичное размножение высокопродуктивных генотипов; сохранение сортимента вегетативно размножающихся культур и важнейших перекрестноопыляемых растений.

С точки зрения селекции для ускоренного размножения представляют интерес растения, обладающие декоративными качествами, не характерными для данного вида – карликовые, с нетипичной кроной (плакучие, стелющиеся, пирамидальные и т.д.), с различной величиной, формой и окраской листьев.

Методы культуры тканей особенно необходимы, когда применение обычных методов размножения затруднены или при наличии трудностей фитосанитарного контроля.

Применение биотехнологических методов значительно ускоряет селекцию древесных пород, при обычном выращивании дающих семена в 35-40 летнем возрасте. Методом микроклонального размножения можно с одного гибридного сеянца в течение шести месяцев получить более 250 побегов для черенкования и укоренения.

Микроклональное размножение интенсивно развивается благодаря следующим причинам: в некоторых случаях традиционный метод вегетативного размножения нерентабелен или низкопродуктивен; размножение отдельных растений невозможно традиционными способами вегетативного размножения; часто при селекции растений необходимо быстро получить несколько растений с идентичным генотипом; при промышленном размножении растений необходимо получение растений, освобожденных от патогенов.

Метод микроклонального размножения имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами вегетативного размножения. Это высокие коэффициенты размножения, сокращение сроков получения посадочного материала, ускорение селекционного процесса, освобождение от патогенных микроорганизмов, и возможно, от вирусов, однородность получаемых растений, экономия площадей под маточными растениями, выращивание растений круглый год, размножение трудноразмножаемых растений.

Преимущества и недостатки микроклонального размножения отражены во многих теоретических работах по этой тематике. В.А.Высоцкий (2001) к преимуществам относит возможность комплексного оздоровления посадочного материала; высокий коэффициент размножения; возможность получения большого количества растений за короткий срок; возможность хранения и накопления растений для высадки в оптимальные сроки; возможность тиражирования форм, обладающих пониженной способностью к репродукции в обычных условиях и получения материала с увеличенным потенциалом к дальнейшему размножению за счет повышенной способности к ризогенезу и образованию большего числа побегов у древесных растений. К недостаткам отнесены: использование биотехнологических методов требует создания специальных лабораторий с соответствующим оборудованием, необходимость высококвалифицированного штата сотрудников, необходимость тщательного отбора исходных форм. Кроме того, в результате микроклонального размножения часто получают материал, плохо подготовленный для выращивания в нестерильных условиях, требующий дополнительных затрат для достижения растениями стандартных показателей. Те же недостатки отмечены в более ранних работах по этой тематике.

Применение микроклонального размножения:

- в селекции для поддержания и размножения небольшого числа отдельных генотипов или новых перспективных сортов, включая и все продукты генной инженерии, полученные in vitro;

- ускоренное размножение (до нескольких тысяч в течение месяцев) новых выведенных сортов, экономя затраты и время на начальных стадиях их внедрения в промышленное производство;

- быстрое получение больших количеств заведомо безвирусного материала как для непосредственной высадки в грунт, так и для дальнейшего размножения обычными методами у тех растений, размножение которых обычными способами не представляет трудностей, но подверженных вирусным заболеваниям (лилии, картофель, земляника и т.д.);

- сохранение генотипа при размножении декоративных форм некоторых гетерозиготных растений, обычно размножаемых семенами (гербера, антирриум);

- получение из определенных клонированных родительских форм семян F1 (цветная капуста), поддержание неинфицированных линий с признаками мужской стерильности (лук) и т.д.

- размножение древесных растений, разведение и селекция которых осуществляется медленно вследствие длительности процесса полового размножения, кроме того, многие из этих видов плохо поддаются традиционному вегетативному размножению.

В основе вегетативного размножения лежат различные механизмы образования и размножения меристематических тканей, дающих начало побегам. Работать можно с любой меристематической тканью, потенциально способной сформировать растения. Культуры in vitro применяемые для размножения, могут быть получены из уже существующих тканей меристемного типа, таких как зародыш, кончик основного побега или образовавшиеся позже пазушные побеги, а также из изолированных органов растения, удобных для получения дополнительных меристематических тканей в виде точек роста или эмбриоидов. При использовании изолированных органов добавочные меристематические ткани могут формироваться непосредственно в родительской ткани, из промежуточного каллуса или клеток суспензионных культур.

Организованные меристемы побегов, по-видимому, генетически стабильны и способны сопротивляться возможному мутагенному действию системы культивирования.

Вероятность получения генетически измененного растения возрастает при образовании придаточных побегов из экспланта, в котором могут присутствовать полиплоидные клетки, в свою очередь способные продуцировать полиплоидные проростки.

Изменчивость деревьев, размноженных in vitro, показывает, что генетические отклонения не являются основной проблемой по крайней мере для некоторых используемых культур побегов и каллусов.

Важно выявить, каким путем сформировались добавочные меристем ткани, поскольку в некоторых случаях в растениях-регенерантах может быть нарушено генетическое единообразие.

Существует несколько основных моделей микроклонального размножения растений, характеризующихся различной степенью надежности в отношении сохранения генетической стабильности размножаемых форм, универсальности для определенного круга растений, коэффициента размножения, повторяемости результатов. К таким моделям относятся:

- получение каллусной ткани с последующей индукцией органогенеза или соматического эмбриогенеза;

- индукция развития побегов непосредственно из ткани экспланта;

- пролиферация пазушных побегов.

При размножении через каллусную и суспензионную культуру процессы индукции органогенеза и эмбриогенеза контролируются соотношениями ауксина и цитокинина, вводимых в питательную среду. Поскольку в единице объема каллусной ткани или в суспензионной культуре содержится до миллиона клеток, каждая из которых потенциально может развиваться в растение, эти методы теоретически наиболее перспективны с точки зрения коэффициента размножения. Однако при дедифференциации клеток может происходить полиплоидизация и анеуплоидизация числа хромосом, что создает риск получить вегетативное потомство с уклоняющимися формами.

Формирование адвентивных почек и побегов. Способность к индукции адвентивных почек в обычных условиях встречается у некоторых видов растений (бегония), что используется для их размножения. Несомненно, что условия in vitro могут в сильной степени стимулировать этот процесс. К сожалению, на данный момент не определена до конца степень получения генетически отклоненных растений.

В основе микроклонального размножения с использованием метода культуры изолированных тканей и органов лежит способность изолированной части растения к формированию полноценного растительного организма, то есть тотипотентность, которая определяется как свойство соматических клеток растения полностью реализовывать свой потенциал развития.

Процесс микроклонального размножения может идти двумя путями: 1) активация развития уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля) и 2) индукция образования почек или эмбриоидов de novo.

Выделение способов в методе микроклонального размножения достаточно условно, так как все они могут происходить одновременно. В основе микроклонального размножения, основанного на активации развития существующих меристем лежит способ вегетативного размножения с помощью отводков и черенков. Вегетативное размножение успешно удается, если апикальное доминирование выражено слабо.

Специализированные клетки разных тканей и органов растений выполняют в целом организме определенные функции и их биохимия, структура и форма коррелируют со спецификой их функций. Однако, если изменить условия, в которых находится специализированная клетка, то в большинстве случаев можно вызвать в ней ростовую активность, дедифференциацию, неорганизованный рост, а при дальнейшем изменении условий – и вторичную дифференциацию, идущую различными путями. Вне организма теоретически каждая живая клетка при создании соответствующих условий способна к делению и росту. Можно предположить, что чем менее структурно и химически специализирована клетка, тем легче она будет дедифференцироваться.

Все ростовые процессы у растений, в том числе и происходящие с клетками, определяются внутренними факторами, среди которых основное место занимает генетическая и гормональная регуляция. Успех культуры изолированных тканей и органов растений зависит главным образом от следующих факторов: генотипа родительских растений, фазы развития и возраста маточных растений, особенностей введения в культуру, состояния экспланта, условий культивирования. Способность к морфогенезу не одинакова у разных органов одного и того же растения. Чем моложе орган, тем быстрее идет развитие экспланта.

Причину различий в регенерационной способности видов, сортов и даже конкретных растений одного сорта связывают с различным содержанием эндогенных регуляторов роста. Известно, что регенерация – многоэтапный процесс, включающий цито- и гистодифференцировку, образование морфогенных структур, побего- и корнеобразование. Интегральный характер регенерационной способности дает основание рассматривать ее как сложный количественный признак с полигенным, а значит, и полигормональным, контролем.

В настоящее время методом культуры тканей выращивают многие виды травянистых растений, широко размножают землянику, хризантему, картофель, орхидеи, фреезию и другие растения.

Получить древесные и кустарниковые растения из меристематических верхушек значительно сложнее, однако работами многих исследователей доказана возможность размножения методом культуры тканей и для древесных растений. Как наиболее перспективный способ микроклонального размножения иногда рекомендуется индуцирование соматического эмбриогенеза как на эксплантах, так и через каллусную культуру.

В настоящее время в технологии in vitro древесных культур достигнут значительный прогресс и размножение некоторых растений приносит практическую выгоду. Тем не менее, остаются широкие возможности улучшения этих методов в плане промышленного производства, а также к объектам, которые все еще не поддаются культивированию. Успешно размножают такие древесные растения, как тополь, клен красный, ель сибирская и лиственница, сосна обыкновенная, элеутерококк, гортензия.

В большинстве случаев исследователями отмечается довольно высокая генетическая стабильность полученных методами микроклонального размножения растений, однако иногда встречаются отклонения от исходного фенотипа и генотипа. Точка зрения, что растения, полученные пролиферацией пазушных меристем, обладают однородностью и выравненностью, все чаще в последнее время подвергается сомнению, особенно если растительный организм рассматривается как гетерогенная система. В стандартных условиях различные растения одного и того же клона отличаются друг от друга в пределах нормы реакции, так как имеют примерно одинаковые механизмы воспроизведения клеток, тканей и органов. В том случае, когда нарушаются деление и рост клеток, могут возникать сомаклональные вариации, отклонения от сортотипа, почковые мутации и т.д. Увеличение изменчивости такого рода считается полезным для селекционного процесса, хотя и нежелательным при размножении какого-либо сорта.

Использование размножения in vitro при выведении новых разновидностей деревьев может оказаться очень важным, так как размножение обычной половой гибридизацией чрезвычайно трудоемко и может длиться многие годы. Более того, существует много экономически важных видов деревьев, являющихся стерильными, для которых улучшение признаков не может быть достигнуто обычными методами селекции.

Растения, полученные с помощью микроклонального размножения, также обладают признаками ювенильности и могут быть использованы для дальнейшего вегетативного размножения, например, зеленым черенкованием.