Інші методи аналізу рослинного матеріалу на наявність генетичних модифікацій.

2.6.1. ВЕРХ та ІЧ-спектроскопія

У випадках, коли хімічний склад ГМО є зміненим (зміни у складі жирних кислот або жирів), для детекції відмінностей у хімічному складі використовують традиційні хроматографічні методи. Дослідження у цьому напрямку проводять на зразках олії ГМ рослин із застосуванням рідинної хроматографії високого тиску разом із мас-спектрометрією. Однак, цей метод може бути застосований лишу у тому випадку, коли в хімічному складі ГМ рослин відбуваються значні зміни. Метод є малоефективним, коли ці зміни не виходять за межі природної варіативності хімічного складу ГМ рослин.

Деякі ГМО можуть містити зміни в будові волокон (якщо йдеться про луб’яні культури) або характеризуватися відмінностями в інших структурних характеристиках. У даному випадку такі зміни можуть бути зафіксовані методом інфрачервоної спектроскопії. Недоліком методики є низька роздільна здатність порівняно з хроматографічними методами.

2.6.2. Біоаналізатор Agilent 2100

Нові технології детекції та аналізу ГМ рослин. У майбутньому прогнозується швидке зростання ГМ-технологій та поява нових генетичних конструкцій, які не будуть містити загальновідомих ГМ-маркерів, таких як 35S помотор або nos-термінатор. Тому розвиток нових методів детекції ГМО є необхідним для ідентифікації різноманіття генетичних конструкцій.

Нові технології в даному випадку є результатом поєднання технологій мікрочіпів та мікрофлюїдних систем. Для аналізу лабораторних зразків таким методом був створений біоаналізатор Agilent 2100, який є системою розділення ДНК на основі чіп-технології. Це система для поведення капілярного електрофорезу в мікрокапілярах, в якій визначення та комп’ютерна оцінка даних здійснюється автоматично. Поведення аналізу на даному приладі має ряд переваг порівняно з традиційним гель-електрофорезом, оскільки використовується короткий роздільний канал та висока напруга електричного поля. В результаті швидкість аналізу значно підвищується порівняно з електрофорезом у шарі гелю. Прилад має флуоресцентний детектор, який дозволяє збільшити чутливість реєстрації [6].

2.6.3. Метод ДНК-чіпів (DNA microarrays)

Метод ДНК-чіпів (DNA microarrays) – методика, що дозволяє аналізувати і визначати тисячі генів, що присутні в досліджуваному зразку, їхні мутації, поліморфізми, а також активність генів в тих чи інших клітинах (при використанні кДНК як матриць для біочіпів).

Технологія створення ДНК-чіпа полягає у тому, що окремий фрагмент ДНК довжиною до 1 тис. пар основ, для якого відомо його розташування в геномі, ампліфікується, і одноланцюгові продукти ампліфікації пришивають до невеликої зони на поверхні предметного скла. Скло розміром 2 × 2 см - ДНК-мікроарей - покрито сіткою ~6 тис. таких мікроплям, кожна з яких містить ДНК певної геномної ділянки. На поверхні ДНК-чіпів синтезуються короткі (до 20 нуклеотидів) олігонуклеотиди: кілька олігонуклеотидів, які походять із однієї ділянки геному, синтезуються поряд. Таким чином, невелика зона містить ДНК, комплементарну індивідуальній геномній ділянці. Фрагментом для ДНК-мікроарея може бути не тільки ділянка геному, а й фрагмент кДНК чи синтетичні олігонуклеотиди. До того ж широко застосовуються також РНК- та білкові-мікроареї.

Для аналізу ДНК, виділену з геному, або кДНК, отриману з виділених мРНК, фрагментують, денатурують і мітять флуоресцентною міткою. Після цього пробу наносять на відповідний мікроарей, який далі аналізують за допомогою флуоресцентного мікроскопа: наявність флуоресцентної плями свідчить про наявністьу геномі певних послідовностей (гени чужорідних організмів), а інтенсивність флуоресценції - про рівень цієї активності [7].

Рис. 5. Принцип методу ДНК-чіпів

2.6.4. Поверхневий плазмон ний резонанс

Ще одним методом, що дозволяє проводити аналіз ДНК нових білків у ГМО є поверхневий плазмонний резонанс (SPR). Основний принцип SRP: тонка плівка, що пропускає світло, розмі­щується на поверхні між матеріалами з різкими показниками зало­млення. Якщо ліганд кон'югований на поверхні біосенсорного типу, то приєднання до нього молекули мішені зразка може бути виміря­не як функція збільшення маси. Зміни в куті відбивання світла, що пропорційні зміні маси на поверхні пластинок (до та після інкуба­ції), занотовуються графічно та вимірюються у відповідних одини­цях. Вищезгадана технологія біосенсорів успішно використовується для скринінгу ГМО зразків.

Рис. 6. Принцип методу поверхневого плазмонного резонансу

2.6.5. Сканометричний аналіз ДНК

Серед інших сучасних технологій ГМО детекції можна виділити сканометричний аналіз ДНК. На поверхні пластинки іммобілі­зують золоті мікрочастинки, покриті близько 200 олігонуклеотидними нитками, які комплементарні до різних ДНК-мішеней. При з'єднанні мікрочастинок з ДНК мішені відбувається їх полімериза­ція та утворення поліструктур, що складаються з тисяч частинок. Далі використовують фотографічний розчин, який покриває кожну золоту частинку сріблом, та генерується сигнал, величина якого пропорційна збільшенню кількості частинок. Фотографія результа­тів детекції може бути отримана за допомогою звичайного планше­тного сканера. Повідомляється про можливість детекції близько 60 молекул ДНК за допомогою цієї техніки без необхідності застосу­вання ПЛР.

Деякі методичні проблеми

Валідація (легалізація) методів аналізу рослин є одним з критичних етапів, що забезпечує надій­ність результатів. В ідеальному випадку, кожен з методів повинен бути сертифікований для використання спочатку в обмеженому числі лабораторій з метою забезпечення відтворюваності та надій­ності результатів. Європейська комісія на початку схвалила метод імуносорбентного аналізу (ELISA) ті ПЛР метод для аналізу сирих матеріалів, що містять Roundup Rсady соєві боби, та ПЛР метод для Bt-176 кукурудзи, а також ПЛР метод для визначення як Roundup Rсady соєвих бобів, так і Bt-176 кукурудзи в продуктах харчування, що піддалися технологічним обробкам. У подальшому було легалі­зовано велике число методів для кількісного та якісного аналізу ГМ рослин та продуктів їх переробки.

Без сумніву, надзвичайно важливим для надійного аналізу є якість самої виділеної молекули ДНК. Сьогодні розроблено та широко використовуються різні модифікації методів виділення ДНК з рослин - виділення за допомогою катіонних СЧАО, за допомогою гуанідинтіоціанату, на іонообмінних смолах тощо. Крім цього, в продажі наявні набори для виділення ДНК від різних фірм-виробників. Напевно, для кожного з об'єктів аналізу потрібно підібрати та оптимізувати свій метод виділення ДНК. Якість виді­леної ДНК перевіряють спектрофотометрично або за допомогою електрофорезу [6].

 

 

ВИСНОВКИ

Метод оцінки фенотипу є недорогим та досить чітким засобом іденти­фікації ГМ рослин у зразках насіння.

ELISA - більш швидкий та менш дорогий метод у порівнянні з ПЛР. Різновиди цього методу (ДНК-кити та індикаторні смужки) дають напівкількісні результати присутності ГМО в зразках, проте мають невисокий поріг детекції. Недоліком імуносорбентного аналізу є певні труднощі кількісних розрахунків, тому що ступінь експресії впроваджених білків у ГМО змінюється залежно від типу тканин, що може впливати на визначення частки ГМ матеріалу в зразках. Метод індикаторних смужок - більш швидкий, проте дає напівкількісні результати, що не можуть гарантувати точну відсут­ність ГМО в матеріалі зразка. Водночас компанії, які займаються виробництвом індикаторних смужок, надають інформацію, що залежно від мети, за допомогою цієї методики можна детектувати ГМО на рівні 0,01 %.

Слід відзначити, що ELISA та індикаторні смужки створені для аналізу специфічних генно-інженерних конструкцій, тоді як деякі білки-мішені можуть бути присутніми в багатьох ГМ рослинах (наприклад, сорти кукурудзи Bt-176, Bt-2 та Моn 810 містять один й той же Cry І білок).

Найбільш коректну ідентифікацію ГМО та найвищий рівень надійності забезпечують сьогодні методи, засновані на проведенні полімеразної ланцюгової реакції. Чутливість ПЛР, як, власне, й інших методів аналізу ДНК, значною мірою визначається чистотою та якістю самої молекули ДНК. Якість виділеної молекули ДНК, у свою чергу, визначається її розмірами та ступенем деградації і залежить від використаних реагентів, методу виділення та ступеня обробки матеріалу (якщо йдеться про зразки, що зазнали певних технологічних обробок). Наявність тих чи інших домішок у препа­ратах виділеної ДНК може впливати на активність і тим самим визначати межу чутливості методу ПЛР. Крім того, чутливість методу полімеразної ланцюгової реакції визначається якістю праймерів, концентрацією іонів магнію та температурним режимом реакції. Однак, принциповим для обговорення питання про межу чутливості методу ПЛР є мінімальна кількість копій трансгенів на геном, яку можна детектувати цим методом.

Експериментально встановлено, що межа виявлення в ПЛР-експериментах становить 0,005% ГМО/неГМО, що відповідає 30 копіям толерантного до гербіциду (RR) гаплоїдного геному сої, або 9 копіям стійкого до шкідників (Bt) гаплоїдного геному кукурудзи. Ці цифри встановлено поетапним розведенням матричної молекули ДНК та проведенням ПЛР і визначенням того ступеня розведення ДНК, коли ще детектуються ПЛР-продукти.