Механизмы репликации кольцевых плазмид

Плазмиды

 

У значительного количества микроорганизмов обнаружены плазмиды вдобавок к основной хромосоме. Это кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, которые могут существовать и реплицироваться как независимо от бактериальной хромосомы, так и быть интегрированными в неё. Плазмиды не являются обязательным для клетки элементом, хотя могут давать определённые преимущества.

Плазмиды представляют собой двухцепочечные молекулы ДНК размером от 10³ до 10⁶ н.п. Они могут быть кольцевой формой и линейными. Плазмиды кодируют не основные для жизнедеятельности бактериальной клетки функции, но придающие бактерии преимущества при попадании в неблагоприятные условия существования.

Среди фенотипических признаков, сообщаемых бактериальной клетке плазмидами, можно выделить следующие:

· устойчивость к антибиотикам;

· продукцию факторов патогенности;

· способность к синтезу антибиотических веществ;

· образование колицинов;

· расщепление сложных органических веществ;

· образование ферментов рестрикции и модификации.

Репликация плазмид происходит независимо от хромосомы с участием того же набора ферментов, который осуществляет репликацию бактериальной хромосомы (см. раздел 3.1.7 и рис. 3.5).

Некоторые плазмиды находятся под строгим контролем. Это означает, что их репликация сопряжена с репликацией хромосомы так, что в каждой бактериальной клетке присутствует одна или, по крайней мере, несколько копий плазмид.

Число копий плазмид, находящихся под слабым контролем, может достигать от 10 до 200 на бактериальную клетку. Для характеристики плазмидных репликонов их принято разбивать на группы совместимости. Несовместимость плазмид связана с неспособностью двух плазмид стабильно сохраняться в одной и той же бактериальной клетке. Несовместимость свойственна тем плазмидам, которые обладают высоким сходством репликонов, поддержание которых в клетке регулируется одним и тем же механизмом. Плазмиды, которые могут обратимо встраиваться в бактериальную хромосому и функционировать в виде единого репликона, называются интегративными или эписомами.

Плазмиды, способные передаваться из одной клетки в другую, иногда даже принадлежащую иной таксономической единице, называются трансмиссивными (конъюгативными) Трансмиссивностъ присуща лишь крупным плазмидам, имеющим tra -оперон, в который объединены гены, ответственные за перенос плазмиды. Эти гены кодируют половые пили, которые образуют мостик с клеткой, не содержащей трансмиссивную плазмиду, по которой плазмиднаяь ДНК передается в новую клетку. Этот процесс называется конъюгацией (подробно он будет рассмотрен в разделе 5.4.1). Бактерии, несущие трансмиссивные плазмиды, чувствительны к «мужским» нитевидным бактериофагам.

Мелкие плазмиды, не несущие tra -гены, не могут передаваться сами по себе, но способны к передаче в присутствии трансмиссивных плазмид, используя их аппарат конъюгации. Такие плазмиды называются мобилизуемыми, а сам процесс — мобилизацией нетрансмиссивной плазмиды.

Особое значение в медицинской микробиологии имеют плазмиды, обеспечивающие устойчивость бактерий к антибиотикам, которые получили название R-плазмид (от англ. resistance — противодействие), и плазмиды, обеспечивающие продукцию факторов патогенности, способствующих развитию инфекционного процесса в макроорганизме. R-плазмиды содержат гены, детерминирующие

синтез ферментов, разрушающих антибактериальные препараты (например, антибиотики). В результате наличия такой плазмиды бактериальная клетка становится устойчивой (резистентной) к действию целой группы лекарственных веществ, а иногда и к нескольким препаратам. Многие R-плазмиды являются трансмиссивными, распространяясь в популяции бактерий, делая ее недоступной к воздействию антибактериальных препаратов. Бактериальные штаммы, несущие R-плазмиды, очень часто являются этиологическими агентами внутрибольничных инфекций.

Плазмиды, детерминирующие синтез факторов патогенности, в настоящее время обнаружены у многих бактерий, являющихся возбудителями инфекционных заболеваний человека. Патогенность возбудителей шигеллезов, иерсиниозов, чумы, сибирской язвы, иксодового бореллиоза, кишечных эшерихиозов связана с наличием у них и функционированием плазмид патогенности.

Некоторые бактериальные клетки содержат плазмиды, детерминирующие синтез бактерицидных по отношению к другим бактериям веществ. Например, некоторые Е. coli владеют Со/-плазмидой, определяющей синтез колицинов, обладающих микробоцидной активностью по отношению к колиформным бактериям. Бактериальные клетки, несущие такие плазмиды, обладают преимуществами при заселении экологических ниш. Плазмиды используются в практической деятельности человека, в частности в генной инженерии при конструировании специальных рекомбинантных бактериальных штаммов, вырабатывающих в больших количествах биологически активные вещества (см. главу 6).

 

Классификация плазмид

I. По способности инициировать процесс конъюгации

1. Конъюгативные (половые, трансмиссивные).

Имеют более крупные размеры; содержат область tra-генов (tra - от TRAnsfer genes), то есть генов, белковые продукты которых обеспечивают конъюгацию. Продукты tra-генов вызывают формирование пили, образуют комплекс ферментов, изменяющих ДНК нужным образом во время переноса, а также противодействуют прикреплению пилей других бактерий к клеточной стенке данной.

2. Неконъюгативные (нетрансмиссивные)

Не содержат области tra-генов, а потому не способны к самостоятельной передаче генетического материала в другие бактериальные клетки. Однако могут использовать белковые продукты трансмиссивных плазмид из той же бактериальной клетки для передачи своего ДНК-материала в ходе конъюгации.

3. Мобилизуемые

Некоторые исследователи выделяют также класс мобилизуемых плазмид, которые содержат только часть tra-генов. Они также способны передавать свой ДНК-материал в ходе конъюгации, используя белковые продукты трансмиссивных плазмид, находящихся в той же клетке.

II. По обычному числу копий плазмиды данного типа в клетках:

1. Высококопийные

2. Низкокопийные

 

III. По группам несовместимости

Совместимость – это способность двух или нескольких плазмид стабильно сосуществовать в одной клетке. Родственные плазмиды обычно не совместимы друг с другом, и вместе образуют одну группу несовместимости.

IV. По функции:

Тип	Свойства
Фактор F (фактор фертильности, фак- тор плодовитости)	Сообщает клетке мужской фенотип, переносится при конъюгации
Факторы F'	Переносят, помимо генов фактора F, гены нуклеотида
Факторы R (факто- ры устойчивости)	Содержат гены устойчивости к различным веществам: кроме того, некоторые из них содержат гены, обеспечивающие конъюгацию
Сol -плазмиды (факторы колициногенности)	Переносят гены, продуцирующие колицины; некоторые также содержат гены, обеспечивающие конъюгацию
Vir - плазмиды	Обуславливают патогенность бактерий
Метаболические плазмиды	Позволяют клетке метаболизировать необычные соединения, например: салициловую кислоту и толуол и т. д.

 

Форма плазмид

Хотя большинство плазмид представляют собой кольцевые молекулы, в настоящее время известно много примеров бактерий с линейными плазмидами. Поскольку линейным плазмидам необходим механизм репликации концов, которого нет у кольцевых хромосом, линейные плазмиды обычно имеются у бактерий с также линейными хромосомами.

Обычно плазмидная ДНК находится в виде ковалентно замкнутого суперскрученного кольца. Если одна из цепей ДНК претерпевает разрыв, то суперскрученная плазмида расплетается в простое кольцо. Если разрыв претерпевают в противоположных позициях обе цепи ДНК, то образуется линейная форма.

Как правило, плазмиды представляют собой кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, однако существуют и линейные молекулы.

Последние были обнаружены как у грамположительных, так и у грамотрицательных бактерий. Их структура может быть двух типов:

1) шпилька на каждом конце молекулы; 2) белок, ковалентно связанный с 5’-концами цепочек.

 

Тип	Свойства
Фактор F (фактор фертильности, фак- тор плодовитости)	Сообщает клетке мужской фенотип, переносится при конъюгации
Факторы F'	Переносят, помимо генов фактора F, гены нуклеотида
Факторы R (факто- ры устойчивости)	Содержат гены устойчивости к различным веществам: кроме того, некоторые из них содержат гены, обеспечивающие конъюгацию
Сol -плазмиды (факторы колициногенности)	Переносят гены, продуцирующие колицины; некоторые также содержат гены, обеспечивающие конъюгацию
Vir - плазмиды	Обуславливают патогенность бактерий
Метаболические плазмиды	Позволяют клетке метаболизировать необычные соединения, например: салициловую кислоту и толуол и т. д.

 

Конформация плазмид

Как правило, плазмиды представляют собой кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, однако существуют и линейные молекулы. Последние были обнаружены как у грамположительных, так и у грамотрицательных бактерий. Их структура может быть двух типов: 1) шпилька на каждом конце молекулы; 2) белок, ковалентно связанный с 5’-концамицепочек.

 

 

Структура плазмид

Плазмиды состоят из ряда элементов. Они содержат важную область генов или локусов, участвующих в их репликации и контроле. Организация этой области соответствует общепринятой модели репликона. Кроме того, плазмиды могут содержать гены, которые можно назвать «необязательными», однако они могут играть важную роль в жизни клеткихозяина.

Плазмиды содержат:

1) точку ori (есть у всех репликонов; это последовательность нуклеотидов, с которой начинается репликация);

2) ген, кодирующий Rep белок, участвующий в инициации репликации плазмиды;

3) гены, кодирующие регуляторные белки репликации;

4) гены, повышающие устойчивость бактерии к неблагоприятным внешним факторам.

 

Механизмы репликации кольцевых плазмид

Существует три основных механизма репликации кольцевых плазмид: тета-(Θ)-репликация, репликация с вытеснением цепи и репликация по типу «катящегося кольца».

Тета-(Θ)-репликация. Данный механизм описан как у грамположительных, так и у грамотрицательных бактерий. Согласно этому механизму, происходит:

1. Расщепление водородных связей между цепями и расплетение двойной спирали ДНК: катализируется белками Rep и DnaA и/или в ходе начала транскрипции плазмиды РНК-полимеразой;

2. Синтез праймерной РНК (пРНК);

3. Инициация синтеза ДНК на праймере, путём его ковалентной модификации – присоединения комплементарных нуклеотидов к 3’-концу.

Тета-репликация может начинаться в одной или нескольких точках ori и быть одно- и двунаправленной. Своё название этот механизм получил благодаря сходству молекулы плазмиды, реплицирующейся по данному механизму, с греческой буквой тета (Θ). Репликация ДНК происходит непрерывно на лидирующей цепи и прерывисто на отстающей (запаздывающей) цепи.

За редким исключением, тета-репликативные плазмиды нуждаются в инициаторном Rep - белке. Некоторые репликоны требуют ещё и участия ДНК-полимеразыI на ранней стадии синтеза ведущей цепи. Последовательности нуклеотидов, с которыми связывается Rep-белок, называются итеронами. Итероны играют ключевую роль в регуляции репликации плазмид и расположены либо в самой точке ori, либо за её пределами. Существуют плазмиды, которые вовсе не содержат итероны – R1, ColE1 и pLS20 (B. subtilis).

Продуктом тета-репликации являются две кольцевые двухцепочечные плазмиды.

Репликация с вытеснением цепи. Может быть одно- и двунаправленной. Вкратце процесс можно описать следующим образом: происходит расплетение двойной спирали хеликазами, а затем синтез новой цепи (или цепей) с вытеснением родительской.

Особенность данного механизма репликации заключается в том, что клеточные белки DnaA, DnaB, DnaC и DnaG не участвуют в процессе удвоения плазмиды. Роль этих белков выполняют RepA (5’→3’ хеликаза), RepB (праймаза) и RepC (инициаторный белок). Для репликации необходима ДНК полимераза III и SSB-белки.

Наименьшая точка ori содержит, как правило, 3 идентичных итерона длиной 20 пар оснований и участок длиной 174 пары оснований, включающий GC- (28 пар оснований) и AT-богатыеучастки (31 пар оснований). Итероны участвуют в связывании RepC белков.

Этапы репликации:

1.Репликация начинается с присоединения белка RepC к итеронам точки ori плазмиды. Хеликаза RepA связывается с обеими цепями в области АТ-повторов(недалеко от сайта связывания RepC) и расплетает двойную спираль ДНК, открывая и активируя ssi - сайты. Однако плавление дуплекса ДНК может быть вызвано и взаимодействием белка RepC с итеронами вблизиssi-сайтов.

2. ssiA и ssiB являются участками, на которых непосредственно синтезируются праймеры и начинается репликация.

3.Именно с ssiA и ssiB связывается RepB (праймаза). Инициация репликации на любом изssi-сайтовплазмидной ДНК может происходить независимо. При этом RepA хеликаза во время синтеза вытесняет нереплицируемую цепь ДНК (в виде D-петли).

Репликация плазмиды с каждого ssi-сайтав противоположных направлениях приводит к образованию двухцепочечной ДНК, имеющей вид буквы тета (Θ), и двухD-петель. На стадии элонгации необходимо участие белка RepA (хеликаза), который не может быть заменен белком DnaB (клеточная хеликаза). Хеликаза RepA движется в направлении 5′→3′, будучи связанной с вытесняемой цепью.

Продукты репликации «с вытеснением цепи»:

—двухцепочечные сверхспирализованные кольцевые ДНК (дцДНК);

—вытесненные одноцепочечные кольцевые ДНК (оцДНК, в случае однонаправленного синтеза);

—частично двухцепочечные кольцевые ДНК (в случае двунаправленного синтеза).

Репликация по механизму «катящегося кольца». Особенность этого механизма в том, что в самом начале процесса одна из родительских цепей разрывается (разрыв фосфодиэфирной связи). В результате образуются свободные 3’- и 5’-концы.К свободному3’-концуДНК-полимеразаначинает присоединять нуклеотиды по принципу комплементарности.

Этапы репликации:

1.Репликация по данному механизму начинается с того, что закодированный в плазмиде Rep -белокразрывает фосфодиэфирную связь на положительной цепи ДНК. Эта область получила название «двухцепочечной точки ori» (или двухцепочечный ориджин – dso).

2.При разрыве образуется свободный 3′-OHконец, который используется как праймер при синтезе лидирующей цепи (при участии ДНК-полимеразы III, SSB - белков и хеликазы).

3. Элонгация с вытеснением родительской положительной цепи продолжается до тех пор, пока реплисома не достигнет сайта dso, на котором синтез лидирующей цепи завершается с замыканием новой цепи и отщеплением родительской положительной цепи, послужившей праймером при синтезе.

Продукты репликации по механизму «катящегося кольца»:

1.Двухцепочечная ДНК (дцДНК), состоящая из родительской отрицательной и синтезированной положительной цепей;

2.Одноцепочечная ДНК (оцДНК), представляющая собой родительскую положительную цепь.

В отличие от репликации с вытеснением цепи, оцДНК, образованные в ходе репликации по механизму «катящегося кольца», всегда соответствуют лишь одной родительской цепи ДНК. Образовавшиеся оцДНК достраиваются до дцДНК клеточными белками, начинающими синтез с участка sso (одноцепочечный ориджин), пространственно удалённого от участка dso. Последний этап – образование супервитков ДНК - гиразами клетки.

Ранее считалось, что этот механизм репликации характерен только для колифагов, имеющих оцДНК, и малых плазмид, выделенных из грамположительных бактерий. Однако впоследствии было показано, что таким образом реплицируются и некоторые плазмиды грамотрицательных бактерий, цианобактерий и даже архей.

Несмотря на то, что большинство изученных плазмид, реплицирующихся по механизму «катящегося кольца», имеют длину не более 10 000 пар оснований и, следовательно, могут быть отнесены к малым плазмидам, не все малые плазмиды реплицируются таким образом. Так, некоторые малые плазмиды грамположительных бактерий реплицируются по тета-механизму.Механизм «катящегося кольца» изучался преимущественно на стафилококковых и стрептококковых плазмидах.