Митохондрии, их строение и функции.

Митохондрии - энергетические станции клеток, - органеллы эукариотической клетки, которые, как полагают, произошли из аэробных бактерий более 1,5 миллиардов лет тому назад. Их основной функцией вляется обеспечение организма энергией.

В тканях млекопитающих митохондрии в процессе окислительного фосфорилирования - (OXPHOS) образуют до 90% молекул АТФ. Известно, что митохондрии являются общепризнаными «фабриками» активных форм кислорода (АФК), а также играют одну из главных ролей в развитии и поддержании окислительного стресса. митохондрии поглощают более 90% кислорода, потребляемого клетками высших животных и человека. При нормальных физиологических условиях 1—5% кислорода, используемого митохондриями, преобразуется в супероксидные анион-радикалы. Митохондриальная АОС включаюет в себя антиокислительные ферменты — марганцевую супероксиддисмутазу (МпСОД), ката- лазу и глутатионпероксидазу — и целый комплекс эндогенных низкомолекулярных антиоксидантов.Активные формы кислорода реагируют с оксидом азота внутри митохондрий, повышая концентрацию высокоактивного пероксинитрита ONOO [20].

Митохондрии вовлечены также и в другие процессы, крайне важные для жизни высших организмов. Окислительный стресс, клеточная смерть, старение, митохондриальные болезни, канцерогенез, как это ни удивительно, связаны по крайней мере частично с процессами окислительного фосфорилирования, структурной целостностью митохондрий и информационной идентичностью их генетического аппарата — митохондриальной ДНК (мтДНК).

Митохондрии являются уникальными клеточными органеллами, трансмембранный электрический потенциал в них может увеличиться до 180 МВ, а значение рН в матриксе равно примерно 8, вследствие чего, в митохондриях могут накапливаться как катионные вещества, так и слабые кислоты в анионной форме. С точки зрения редокс-статуса митохондрии являются наиболее восстановленным компартментом клетки.

Число митохондрий в каждой клетке различно и зависит от возраста клетки и типа ткани (определяется энергетическими потребностями клетки). В одной соматической клетке может содержаться от 200 до 2000 митохондрий. Наибольшее количество митохондрий находится в скелетных мышцах, в мышцах сердца, печени и мозге. Митохондрии составляют 25-30% от массы миокарда. Митохондрии встречаются в каждой человеческой клетке, за исключением зрелых эритроцитов.

В процессе движения митохондрии способны распадаться на мелкие образования или, наоборот, собираться в крупные агрегаты. Агрегация митохондрий может происходить при делении и почковании клеток дрожжей, при этом происходит характерная ориентация и направленное движение митохондрий.

Деление митохондрий в клетках дрожжей начинается примерно к 1/5 клеточного цикла после начала деления ядра и заканчивается за 1/5 до конца цикла. Такая регулярная периодичность свидетельствует о существовании тесной связи между митохондриальным и ядерным делениями.

Каждая митохондрия окружена оболочкой, состоящей из двух мембран: наружной и внутренней (Риа1 слайд). В состав наружной мембраны входит много копий белка, называемого порином, который образует широкие гидрофильные каналы в липидном бислое (митохондриальный порин VDAC - voltage-dependent anion channel). Порины обеспечивают осмотически неактивный перенос метаболитов и соединений различной природы с молекулярной массой до ~ 5 кДа в межмембранное пространство.

Внутренняя мембрана, ограничивающая матрикс митохондрий, образует многочисленные складки или кристы. В состав внутренней мембраны входят также разнообразные транспортные белки (транслоказы), 8обусловливающие ее избирательную проницаемость для тех малых молекул, которые либо метаболизируются многочисленными ферментами, сконцентрированными в матриксе, либо необходимы для их активности.

Во внутренней мембране локализованы все компоненты дыхательной цепи (за исключением цитохрома С, находящегося в межмембранном пространстве), необходимые для процесса окислительного фосфорилирования, дающего большую часть АТФ в животных клетках. Получение доступной энергии в виде высокоэнергетической фосфатной связи молекулы ATP обусловлено, главным образом, именно функционированием дыхательной цепи, формирующей на мембране необходимый для работы Н⁺-АТP-синтазы протонный потенциал ΔрН, и, в меньшей степени, субстратным фосфорилирова нием. Считается, что внутренняя мембрана митохондрий проницаема для супероксида, но сейчас имеются данные, опровергающие этот факт.

Пространство внутри митохондриальной мембраны называется митохондриальным матриксом. В матриксе содержится широчайший спектр ферментов цикла трикарбоновых кислот (цикла Кребса), пируватдегидрогеназного комплекса, β-окисления жирных кислот, а также многих других метаболических процессов. Митохондрии содержат и другие оксидоредуктазы, субстратом-окислителем которых служит митохондриальный убихинон. В митохондриальном матриксе также расположена мтДНК.

В процессе окислительного стресса из-за ПОЛ в мембранах возрастает доля упорядоченных липидов с ограниченной подвижностью. Вязкость мембраны повышается. Отрицательный заряд на поверхности мембраны повышается в связи с тем, что вторичные продукты ПОЛ (альдегиды, кетоны, эпоксиды) несут карбонильные и карбоксильные группы. При этом проницаемость плазматических и внутриклеточных мембран резко изменяется для ионов, неэлектролитов и даже макромолекул. Это приводит к потере митохондриями способности осуществлять синтез АТФ, и клетка оказывается в условиях энергетического голода, а также к уменьшению стабильности липидного слоя, что может привести к электрическому пробою мембраны собственным мембранным потенциалом. Электрический пробой приводит к полной потере мембраной ее барьерных функций.

Цикл Кребса, ЭТЦ и АФК.

Цикл Кребса, на ряду с β-окислением жирных кислот, является основным источником восстановленных эквивалент NADH и FADH_2, вступающих затем в ЭТЦ. В ходе этого процесса АФК не образуется, но ЦТК по действием АФК нарушаться, т.к. один из ключевых ферментов – аконитатгидратаза (АкГ), обеспечивающая катализ превращения цитрата в изоцитрат, легко разрушается под действием АФК, т. к. она содержит [4Fe-4S]2+ кластер, в связи с чем, АкГ можно рассматривать в качестве критической мишени действия свободных радикалов. АкГ принадлежит основная роль в регуляции накопления лимонной кислоты. При этом из Fe_S кластера высвобождается ион Fe2+, являющийся прооксидантом.

Дыхательная цепь или цепь транспорта электронов представляет собой совокупность последовательных окислительно-восстановительных реакций, в ходе которых происходит перенос электронов от исходного донора к терминальному акцептору кислороду. Вся цепь реакций проходит при участии белковых молекул - переносчиков. Белковые молекулы встроены во внутреннюю мембрану митохондрий и образуют дыхательные комплексы. Система окислительного фосфорилирования состоит из пяти ферментативных комплексов:

Комплекс I (NADH дегидрогеназа) окисляет NAD-Н, отбирая у него два электрона и перенося их на растворимый в липидах убихинон, который внутри мембраны диффундирует к комплексу III. Вместе с этим, комплекс I перекачивает 4 протона из матрикса в межмембранное пространство митохондрии.

• Комплекс II (Сукцинатдегидрогеназа) не перекачивает протоны, но

обеспечивает вход в цепь дополнительных электронов за счёт окисления сукцината.

• Комплекс III (Цитохром bc1 комплекс) переносит электроны с

убихинона на два водорастворимых цитохрома с. Убихинон передаёт 2 электрона, а цитохромы за один цикл переносят по одному электрону.

• Комплекс IV (Цитохром с оксидаза) катализирует перенос 4 электронов с 4 молекул цитохрома с на O2 и перекачивает при этом 4 протона в межмембранное пространство. Комплекс состоит из цитохромов а и a3, которые, помимо гема, содержат ионы меди.

• Комплекс V (АТФ - синтаза) - комплекс, состоящий из двух частей:

одна часть F0 - это протонный канал, другая часть F1 - выполняющая каталитическую функцию, отвечает за синтез АТФ.

В ЭТЦ восстанавливается 93 - 95% молекулярного кислорода, однако другие 5 - 7% могут оставаться не полностью восстановленными, формируя реакционно активные соединения, свободные радикалы. Другим путем возникновения активных форм кислорода называют дополнительные реакции в цепи, протекающие как спонтанно, благодаря разности окислительно-восстановительных потенциалов или возникновению побочных продуктов реакций, так и за счет вспомогательных реакций, осуществляющих окисление субстратов помимо цепи переноса электронов. Так, при измерении окислительно-восстановительного потенциала реакции преобразования O2 в O2˙ в нормальных условиях (pH 7,0) ученые показывают, что данное значение является промежуточным между потенциалами начального и конечного звена электрон-транспортной цепи и составляет -0,160 В. Сильное увеличение концентрации АФК может приводить к инактивации железосерных центров комплексов I, II и III дыхательной цепи и цис-аконитазы цикла Кребса, что в свою очередь приводит к снижению продукции АТФ митохондриями.

Дыхательная цепь включает окислительные центры с потенциалами от - 0,320 В (NAD(P)H) до +0,39 В (цитохром а3). Следовательно, термодинамически дыхательные компоненты этих центров (железо-серные кластеры, семихинон, флавопротеины) вполне способны к переносу электронов с образованием супероксид аниона. Кроме того, многие этапы переноса электронов содержат одноэлектронные переносчики, которые также способны осуществлять моновалентное восстановление кислорода (промежуточные формы восстановленного кислорода). Образующийся супероксид - анион затем превращается в перекись водорода H2O2 под действием митохондриальной супероксид- анион-дисмутазы, содержащей ионы Mn. Согласно другим данным помимо системы цитохромов источником активных форм кислорода могут являться побочные реакции, такие как метаболизм ксантина, гипоксантина, L- и D-аминокислот: при этом происходит перенос протонов непосредственно на молекулярный кислород с образованием пероксида водорода.

На образование перекиси водорода расходуется до 3% от общего количества кислорода, поглощаемого митохондриями. Митохондрии, выделенные из различных тканей, образуют перекись водорода при аэробном окислении различных субстратов. Наблюдаемая скорость образования перекиси сильно зависит от ткани- источника митохондрий, применяемых субстратов-доноров, ионного состава и рН среды измерения, а также использованного метода определения АФК. Метаболическое состояние митохондрий прямо связано с их способностью к генерации перекиси водорода: так при контролируемом окислении сукцината в отсутствие ADP продукция Н2О2 максимальна, тогда как в присутствии разобщителей или при добавлении ADP скорость генерации резко снижена. H2O2 в присутствии переходных металлов также может превращаться в высоко реакционно-способный гидроксил-радикал OH.

Продукция любой АФК митохондриями – многофакторный процесс. Например, суммарная регистрируемая скорость образования перекиси водорода в митохондрияхв различных случаях может определяться:

1) активностью транслоказ малата, глутамата и аспартата и малата, пирувата и цитрата;

2) активностями малатдегидрогеназы и трансаминазы и пируватдегидрогеназного комплекса (ПДГК) и цитратсинтазы;

3) активностями ферментов, образующих перекись водорода;

4) активностями внутримитохондриальных ферментов, разрушающих АФК (так называемая система «антиоксидантной» защиты), к которым относятся глутатионредуктаза, глутатионпероксидаза, каталаза, пероксиредоксины, глутаредоксины и две СОД (матриксная и межмембранная);

5) скоростью транспорта образующейся перекиси водорода во внешнюю среду.

В определенных условиях работы электронтранспортной цепи возможно также одно-электронное восстановление кислорода, взаимосвязанное с его более высоким сродством к убихинону по сравнению с цитохромоксидазой. Это сопровождается образованием супероксиданионрадикала. Были выявлены специфические компоненты дыхательной цепи - источники АФК. Они пречислены в таблице 2 (слайд) перечислены митохондриальные ферменты, для которых экспериментально показана их способность образовывать АФК. Содержание этих ферментов в митохондриях разных тканей сильно различается. Так, например, ферменты 1-4 и 7 высокоактивны в митохондриях всех изученных тканей, тогда как активность фермента 8 особенно велика в митохондриях бурого жира и тканях насекомых. Данные об относительной активности ферментов 5, 6 и 9 в различных тканях ограничены и/или противоречивы.

НАD(Р)Н-ОКСИДАЗА (NOX4)

NOX4 - единственный представитель этого семейства, который образует не супероксид-радикал, а перекись водорода, несмотря на то, что молекула кислорода восстанавливается при участии одноэлектронного переносчика (гема b).

Моноаминооксидаза

Дополнительно существенным источником Н202 является окислительное дезаминирование биогенных аминов, протекающее во внутренней митохондриальной мембране под действием фермента моноаминок- сидазы, что способствует увеличению стабильной концентрации активных форм кислорода в пределах матрикса митохондрий и цитозоля.