Моноклональні антитіла, їх одержання та використання в медичній практиці.

Моноклональні антитіла — це препарати антитіл, високоспецифічні до однієї антигенної детермінанти, одержані з одного клону клітин-продуцентів in vitro. Продуцентами моноклональних антитіл є гібридоми — клітини, одержані шляхом злиття лімфоцита та мієломної клітини. Лімфоцит,як високодиференційована клітина, продукує антитіла однієї специфічності in virto, але не розмножується. Мієломна клітина, що походить із злоякісної пухлини, має здатність до безмежного розмноження. Гібридомна ж клітина розмножується, утворюючи клон, який продукує антитіла.

Етапи одержання моноклональних антитіл:

1. Імунізація тварин певним антигеном.

2. Одержання лімфоцитів від імунізованої тварини.

3. Одержання гібридом. Лімфоцити поодинці розміщують у мік-рокамерах спеціальних панелей і додають мієломні клітини. Завдяки дії спеціального "ферменту злиття" або інших речовин, що впливають на клітинні мембрани, утворюються гібридні клітини. При цьому застосовують спеціальне інкубаційне середовище, в якому ні лімфоцит, ні мієломна клітина не виживають, а гібридома розмножується.

4. Відбір гібридом, які продукують потрібні антитіла. Досліджуючи наявність потрібних антитіл у культуральній рідині, відбирають необхідний клон.

5. Вирощування клону в промислових біотехнологічних умовах і одержання комерційних препаратів моноклональних антитіл.

Як правило, діагностичні моноклональні антитіла випускають міченими радіоізотопом або ферментом. Застосовують їх для виявлення антигенів, коли важливо уникнути перехресних реакцій із близькими антигенами. У мікробіології сфера їх застосування — ідентифікація бактеріальних, вірусних та інших антигенів. У неін-фекційній імунології — виявлення поліпептидних та білкових гормонів (наприклад, рання діагностика вагітності на основі' виявлення гормону гонадотропіну в сечі). Важливе значення має застосування моноклональних антитіл для ранньої діагностики злоякісних пухлин на основі виявлення "ракових" антигенів, розроблені спеціальні тест-системи для діагностики раку кишкового тракту, пухлин жіночих статевих органів та ін.

 

 

36,Взаємодіяантигенів і антитіл. Серологічніреакції, їхфеномени. Практичневикористання Серологічними реакціями (у діагностиці інфекційних захворювань) називають сукупність пробіркових реакцій, заснованих на АГ-АТ-взаємодії. Серологічні дослідження — це методи вивчення визначених антитіл чи антигенів у сироватці крові хворих, засновані на реакціях імунітету (проводяться in vitro).1) Направлені на виявлення в сироватці крові й інших рідинах організму АТ до АГ збудників інфекційних хвороб.2) Пробірочні реакції, що мають метою виявлення в сироватці крові й інших субстратів розчинних мікробних АГ за допомогою стандартних імунних сироваток.Серологічні реакції проводяться з використанням1) АГ для пошуку АТ2) АТ для пошуку АГ3) IN VIVO (шкірні проби, РН in vivo.)4) серопрофілактика (введення АГ, АТ)В серологічні методи не входять реакції, що ставлять на людях чи тваринах (реакція Шику, Дика), і серологічна ідентифікація культур мікроорганізмів (це один з етапів бактеріологічних методів).Класифікація серологічних реакцій1. Двухкомпонентні- прості (РА,РП)- розеточні тести- цитофлюоресцентні методи- складні (РН /гемадсорбції, токсину,.,РТГА,РНГА, реакція прямої імунофлюоресценції, реакції адгезії).Реакції адгезії відрізняються взаємодією часток, наприклад, клітки, із серологически активною поверхнею, у т.ч. з інший кліткою.2. Трикомпонентні- прості- реакція бактеріолізу,- реакція коагглютинації- складні- реакція непрямий иммунофлюоресценции,- РІА,- РЕМА,- літичні тести (РСК, визначення АОК за допомогою еритроцитарних Аг-ів),- використання електронних парамагнітних і ядерно-магнітного резонансу),Матеріал для серологічних реакцій:- сироватка крові (парні сироватки). Заморозку протягом 10-14 днів.- ліквор,- сеча,- фільтрат випорожнень,- промивні води бронхів, порожнини рота, ковтки, носа /2640до/,шлунка.- Слиз (шийки матки,. - тут АТ часом більше, ніж в сироватці)Облік серологічних реакцій здійснюється відуально, іноді за допомогою лупи і рідко -мікроскопа.При оцінці серологічних реакцій застосовують 3 головних критеорія:- наявність і інтенсивність реакції (у плюсах і ін.),- діагностичний титр, заздалегідь відпрацьований для всіх захворювань,- наростання титру АТ протягом хвороби в 4 і більш рази.Виявлення в сироватці крові хворого антитіл до збудника інфекції чи відповідного антигену дозволяє встановити причину захворювання.Серологічні дослідження містять у собі різні серологічні реакції:1. Реакція аглютинації.2. Реакція преципітації.3. Реакція нейтралізації.4. Реакція за участю комплементу.5. Реакція з використанням мічених чи антитіл антигенів.Серологічні дослідження застосовують також для визначення антигенів груп крові,тканинних антигенів і рівня гуморальної ланки імунітету. 37.Реакція аглютинації, її механізм, різновидиРеакції аглютинації — це прості реакції склеювання корпускулярних антигенів за допомогою антитіл.Розрізняють:— прямі реакції аглютинації, що використовують для виявлення антитіл у сироватці крові хворого. Додавання суспензії убитих мікробів до сироватки хворого викликає утворення пластівчастого осаду (позитивна реакція склеювання мікробів антитілами). Використовується для визначення черевного тифу, паратифу й ін.— реакція пасивної, чи непрямий гемагглютинації заснована на використанні еритроцитів з адсорбованими на їхнє поверхні антигенами, взаємодія яких з відповідними антитілами сироватки крові хворих приводить до утворення фестончатого осаду. Використовується для визначення вагітності, виявлення підвищеної чутливості хворих до лікарських препаратів і гормонів;— реакція гальмування гемагглютинації заснована на здатності антитіл імунної сироватки нейтралізувати віруси, що у результаті утрачають властивість склеювати еритроцити. Використовується для діагностики вірусних хвороб;— реакція коагглютинації — різновид реакції аглютинації, у якій антигени збудника визначають за допомогою стафілококів, попередньо оброблених імунною діагностичною сироваткою 38.Реакціяпреципітації, їїмеханізм. Використання в медичнійпрактиці. Реакціяпреципітації в геліРеакції преципітації — реакції, у яких відбувається осадження комплексу антиген-антитіло. Антиген у даному випадку повинний бути розчинним. Осад комплексу антиген-антитіло називається преципітатом. Реакцію ставлять шляхом нашарування розчину антигену на імунну сироватку. При оптимальному співвідношенні антиген-антитіло на границі цих розчинів утвориться непрозоре кільце преципітату. Діаметр кільця преципітації пропорційний концентрації антигену. Найбільше поширення одержала реакція преципітації в напіврідкому гелі агару (подвійна иммуно-иммунодиффузия, іммуноелектрофорез і ін.). Реакцію використовують для визначення змісту в крові імуноглобулінів різних класів, компонентів системи комплементу.Для аналізу складу антигенів широкого поширення набула реакція преципітації в гелі. Розрізняють просту і подвійну дифузію в гелі. Проста імунодифузія - агаровий гель, який містить приципітуючу сироватку, поміщають у вузькі пробірки і зверху нашаровують розчин антигена; дифундуючи в гель, антиген зв’язується з відповідними антитілами, утворюючи мутні лінії преципітації; розміщення ліній в агарі визначається концентрацією відповідного антигену. Подвійна імунодифузія - на відміну від попереднього методу у цій реакції реагенти розділені шаром нейтрального гелю, який не містить реагентів; на поверхню гелю, змішаного з специфічною сироваткою. Вносять шар нейтрального гелю, після застигання якого нашаровують антиген, дифундуючи на зустріч один одному. Антиген і антитіла зустрічаються в шарі нейтрального гелю і утворюють лінії преципітації.
Феномен преципітації широко використовується в мікробіологічній практиці. Зокрема, в судово-медичній експертизі його застосовують для визначення видової належності крові. За допомогою специфічних преципітуючих сироваток проти білка людини, різних тварин і птахів можна встановити, якому виду належить виявлена кров. Таким чином визначають можливу фальсифікацію продуктів. Ця реакція застосовується для діагностики епідемічного цереброспінального менінгіту, чуми, дизентерії. Особливе значення має реакція термопреципітації Асколі, яку використовують для визначення інфікованості збудником сибірки продуктів і матеріалів тваринного походження. 39.Реакції лізису. Реакція зв’язування комплементу, її практичнее використання Лізис бактерій відбувається за участю двох інгредієнтів: специфічного антитіла, яке є в імунній сироватці, і неспецифічної речовини будь-якої нормальної й імунної сироватки — комплементу.Реакція лізису моносистемна, непряма, трикомпонентна. У зв'язку з нестійкістю комплементу в реакціях лізису використовують консервований комплемент, найчастіше сироватку крові морської свинки. Отже для реакції лізису необхідні антиген, антитіло й комплемент. Антигеном можуть бути мікроорганізми, еритроцити або інші клітини. Як антитіло (лізин) використовують специфічну сироватку або сироватку хворого. Залежно від того, проти яких клітин спрямована дія лізинів, вони мають свої назви: проти бактерій – бактеріолізини, спірохет – спірохетолізини, еритроцитів – гемолізини, проти інших клітин – цитолізини. Комплемент при утворенні комплексу клітина (антиген) – антитіло, звязується з ним, активується за класичним шляхом і викликає розчинення клітини. Без комплементу лізис клітини неможливий. Розрізняють декілька реакцій лізису: бактеріолізу, гемолізу, цитолізу. Реакція зв'язування комплементу Характерною відмінністю РЗК від реакції аглютинації й преципітації є участь в ній, крім антигена й антитіла, інгредієнтів реакції гемолізу, яка виступає у вигляді індикаторної системи. Взаємодія антигена з антитілом не завжди зумовлює візуальні зміни, які дозволяють визначити результат реакції. Проте відомо, що при утворенні комплексу антиген - антитіло до нього завжди приєднується комплемент. Якщо антиген і антитіло не відповідають один одному, то комплемент не звязується, залишається вільним у системі. При додаванні комплексу еритроцити барана – гемолізини вільний комплемент, звязуючись з ним, викликає гемоліз еритроцитів. Цей принцип і покладенов основу РЗК. При відповідності антигена антитілу з ним звязується комплемент. Щоб переконатись в цьому, додають еритроцити барана й гемолітичну сироватку. При відсутності гемолізу роблять висновок, що реакція позитивна, при наявності гемолізу – реакція негативна.РЗК набула широкого розповсюдження для діагностики багатьох інфекційних захворювань, алергічних станів. Вона використовується для серологічної діагностики захворювань бактерійної етіології (сифілісу, лептоспірозу, бруцельозу, туляремії, лістеріозу, озени, орнітозу та інш.), вірусного походження (грипу, паротиту, цитомегалії, поліомієліту, лімфоцитарного менінгіту, енцефаліту тощо), грибкових (кандидозу, асперігельозу), а також токсоплазмозу, пневмоцистозу тощо. 40Реакції з міченими антитілами або антигенами. Принципи та використання реакцій імунофлуоресценції (РІФ), імуноферментного та радіоімунногоаналізу а)Ріф - полісистемна,непряма, гетерологічна.У діагностиці застосовують пряму і непряму Ріф. Використовують антитіла,мічені флуоресцентним барвником - ізоціанатом флюороесцеїну. З'єднуючись з антигеном вони утв. комплекс,який при дії У-ф випромінювання дає яскраво-жовте світіння. Пряма Ріф: взаємодія між антигеном і специф. антитілами обробленими флюор. барвниками. Непряма Ріф:спочатку зв’язують антиген з неміченим антитілом,потім комплекс обробляють міченим анти-γ-глобуліном.Комплекс антиген-антитіло-антиглоб. легко виявляють у люмінесцентному мікроскопі.
б)Іфа- взаємодія антигену з антитілом,хімічно зв’язаним з ферментом. Комплекс набуває ферментативної активності і розщеплює відповідний субстрат з появою забарвлення і люмінесцентним ефектом. Прямий Іфа- визначає наявність антигену, непрямий антитіл.(до комплексу антиген-антитіло проти якого-небудь антигену добавляють мічений ферментом антиглобулін проти 1-ої імунної сироватки і хромогенний субстрат). Ефект позитивної реакції: темно-коричневе забарвлення рез-таті з'єднання анти глоб. сироватки, що несе імунофермент. комплекс, з імуноглоб. досліджуваної сироватки.
Простий і доступний метод для виявлення антитіл і антигенів при різних захворюваннях.
в)Ріа- використовують стандартні к-сті антисироватки проти дослідж. антигену і к-сть цього антигену, міченого радіонуклідом. Для мічення найчастіше використовують 2 нукліди:тритій 3Н і 125І йод. Радіоактивність заміряють лічильниками γ-проміння. Чим більша к-сть дослід. антигена, тим менше міченого антигену зв’язується з антитілами. Ріа найчутливіший імунологічний метод,дозволяє виявляти слідові к-сті білка(нано-, пікограми). 41.Реакції гіперчутливості,їх типи, механізм розвитку. Поняття сенсибілізації та десенсибілізації а)Гіпер. нег. типу пов’язана з β-системою імунітету. Проявляється незабаром після введення антигену. У розвитку бере участь реакція антиген-антитіло в тканинах і рідких тканинних середовищах, може передаватись від однієї тварини до іншої введенням імунної сироватки сенсибілізованих тварин. Відносять до г. н. типу анафілаксію,сироваткову хворобу, атопії та інш.
б)Гіпер. упов. типу пов’язана з Т-системою імунітету. Може передаватись ввденням лімфоїдних клітин сенсибілізованого орг-му. Сенсибілізовані Т-лімфоцити несуть на своїй поверхні рецептори, специфічні до кожного антигену, завдяки яким вони зв’язуються з чужорідним антигеном і руйнують його за допомогою ферментів, лімфокінів. До гіп. упов. типу належать інфекційна і контагіозна алергія,ауто алергічні реакції, реакції при трансплантації.
Алерг. реакції широко використовують у діагностиці інф. Захворювань у вигляді шкірних проб, реакцій бласттрансформації лімфоцитів, специфічного розетко утворення, ушкодження нейтрофільних гранулоцитів та ін. Визначення к-сті лімфокінів та їх активності – діагностика сепсису і визначення ефективності протипухлинної терапії.Порівняння

ГНТ	ГУТ
1. розвивається через 15-20 хв після повторного введення АГ	1. розвивається через декілька годин або днів
2. зв’язана з LgE	2. не зв'язана з LgE але зв’язана з Т-л.ф. (Т-лімфоцит)
3. можливий пасивний перенос за допомогою АТ	3. пасивний перенос неможливий, але можна перенести алергію за допомогою Т-л.ф. (адаптивний перенос)
4.АГ-алергени найчастіше розчинні білки сироватки, токсини МіО тварин і рослин	4.алергени – курпускулярні (бактерії, віруси) хімічні алергени
5.відбувається в тканинах гладкої мускулатури, у кровоносних судинах	5. відбувається найчастіше у шкірі
6. можлива десенсибілізація	6. десенсибілізація не можлива. Стан ГУТ зберігається дуже довго

Механізм: ГНТ зв'язаний з виробленням антитіл, а ГУТ із клітинними реакціями. ГНТ вперше описана Рише, Портье і Сахаровим. Установлено що ГНТ виникає при утворенні комплексу антиген-антитіло і дії цього комплексу на чуттєві клітки. Виявляється: в анафілаксії, сироватковій хворобі. ГУТ вперше описана Кохом. Ця форма прояву не зв'язана з антитілами, опосередкована клітинними механізмами за участю Т-лімфоцитів. До ГУТ відносяться: контактна алергія, уповільнена алергія до білок, туберкулінова реакція. Антиалергічні препарати: Диазолин, супрастин, гистамин, натрію тіосульфат. Десенсибілізація (від де... і сенсибілізація) (біологічна), зменшення або усунення підвищеної чутливості організму (сенсибілізації) до повторного введення чужорідної для нього речовини (алергену), частіше за білкову природу. При введенні в організм чужого йому білка утворюються специфічні речовини — антитіла, взаємодія яких з білком при його повторному введенні може викликати сироваткову хворобу або інші форми алергічної реакції Сенсибілізація (франц. sensibilisation, від латів.(латинський) sensibilis — чутливий) (біологічна), придбання організмом специфічної підвищеної чутливості до чужорідних речовин — алергенів. С. можуть викликати бактерії і віруси (їх антигени і токсини), хімічні речовини, у тому числі багато лікарських засобів, промислові отрути і т. д.Сенсибілізірующие властивості різних алергенів залежать не лише від кількості введеної речовини, але і від його якісних особливостей і фізичного стану антигенів. Так, стан аутосенсибілізації виникає частіше до власних пошкоджених білок в результаті освіти в організмі аутоаллергенов. Глобуліни кінської сироватки, як і еритроцити, більш анафілактогенни, ніж альбумін і гемоглобін. Повторна дія алергенів на сенсибілізований організм може викликати алергічні реакції типаанафілаксії — сироваткову хворобу, Артюса феномен (різкий місцевий запальний набряк). Час між першим попаданням в організм алергену і виникненням підвищеної чутливості до нього (цей стан називається алергією) визначають як період С.; він може вагатися від декількох діб до декількох місяців і навіть років. Початкові етапи розвитку алергічних реакцій багато в чому нагадують процес розвитку імунітету і також супроводяться фіксацією алергенів в клітках ретикулоендотеліальної системи, плазматизацією лімфоїдних кліток і виробленням в них антитіл. У організмі підвищується клітинна чутливість, накопичуються специфічні антитіла, здатні з'єднуватися лише з тим алергеном, який викликав їх освіту. 42.Імунодефіцити і стани. Первинні та вторинніімунодефіцити. АвтоімуннізахворюванняПервинний імунодефіцит - це спадкове або набуте в період внутрішньоутробного розвитку стан, при якому спостерігаються проблеми в роботі імунної системи. Іншими словами, дитина народжується без здатності захищатися від будь-яких інфекцій та вірусів. Первинний імунодефіцит у дітей діагностується в ранньому віці. Хворі з важкою формою, як правило, помирають. При деяких формах захворювання перші симптоми можуть бути виявлені вже в дорослому віці. Таке зустрічається при наявності у пацієнта хорошою компенсування певної форми хвороби. Клінічна картина виражена повторними і хронічними інфекційними процесами. Часто вражає бронхолегеневу систему, ЛОР-органів, шкіру і слизові оболонки. Первинний імунодефіцит може призвести до розвитку гнійного лімфаденіту, абсцесу, остеомієліту, менінгіту та сепсису.Деякі форми проявляються алергіями, аутоімунними захворюваннями, можуть спровокувати розвиток злоякісних пухлин. Допоможе розпізнати первинні імунодефіцити імунологія - наука, що займається вивченням механізмів самозахисту організму від будь-яких шкідливих речовин.Діагностуються вроджені імунодефіцити досить важко. Первинні імунодефіцити: класифікація Імунодефіцитом позначають стійка зміна в імунній системі, причиною якого стає дефект в одному або декількох механізмах імунної відповіді. Розрізняють чотири його види:Вікові, що виникають в ранньому дитинстві або в старості. Придбані.Інфекційні, спровоковані вірусом.Вроджені (первинні імунодефіцити).Класифікація первинної імунної недостатності наступна:Імунна недостатність, пов'язана з ураженням декількох видів клітинІмунна недостатність, зумовлена ураженням переважно Т-клітин: синдром Ді Джорджа, для якого характерна відсутність або недорозвинення тимуса (Вилочкової залози) і паращитовидних залоз,вроджені вади серця, деформації в будові особи. Захворювання може супроводжуватися аномаліями у розвитку скелета, нирок, нервової системи.Імунна недостатність, з переважним ураженням В-клітин.Поразка мієлоїдних клітин провокує первинний імунодефіцит. Хронічна гранулематозная хвороба має виражений дефект у виробленні активних форм кисню. Внаслідок цього виникають хронічні інфекції, спровоковані бактеріями або грибками.Імунодефіцити, пов'язані з дефектами в системі комплементу. Ці дефекти призводять до нестачі або повної відсутності різних складових комплементу.Відрізняються також клітинні, клітинно-гуморальні і первинні гуморальні імунодефіцити. До клітинної формі імунної недостатності можна віднести дефекти, пов'язані з дефіцитом лімфоцитів, макрофагів, плазмоцитів. Гуморальна форма обумовлена дефіцитом антитіл. Що таке вторинний імунодефіцит? Цей вид імунодефіциту не є спадковою хворобою. Вона набувається протягом життя. До його розвитку може призвести вплив факторів біологічного, хімічного та екологічного характеру. Не захищені від вторинного імунодефіциту і люди, які ведуть неправильний спосіб життя, неправильно харчуються, перебувають у постійному стані стресу. Хворими найчастіше є дорослі. Класифікація вторинних імунодефіцитів Серед вторинних станів імунної недостатності виділяю три форми:набута, прикладом якої вважається СНІД, спровокований ураженням імунної системи вірусом імунодефіциту людини;индуцированная, що виникає в результаті впливу конкретних подразників у вигляді рентгенівського випромінювання, застосування кортикостероїдів, травм та хірургічних втручань;спонтанна, що характеризується відсутністю явної причини, що призвела до виникнення імунної недостатності.Вторинні імунодефіцити також ділять на оборотні і необоротні. Варіантом оборотної імунної недостатності може бути голодування і пов'язаний з цим дефіцит життєво важливих компонентів. ВІЛ-інфекція є прикладом незворотною форми імунодефіциту. Автоіму́нні захво́рювання (англ. Autoimmune diseases, часто також — автоімунні порушення, англ. Autoimmune disorders) — хвороби, при яких імунітет організму мобілізується не проти сторонньої сполуки, біологічного організму (вірусів, мікроорганізмів тощо) (антигену), а проти клітин, тканин власного організму. Внаслідок вироблення автоімуннихантитіл, які з'єднуються із автоантигеном і комплементом, виникає запалення.Таким чином, розвиваються автоімунні хвороби, при яких відбувається ураження тієї чи іншої системи: нервової, м'язової, ендокринної, серцево-судинної, сполучної тканини, печінки, шкіри тощо. Через це у МКХ-10 ці хвороби віднесені до різних класифікаційних груп.До автоімунних хвороб відносять велику кількість системних хвороб сполучної тканини (зокрема ревматоїдний артрит,системний червоний вовчак, синдром Бехчета, синдром Шегрена) та інших систем організму — розсіяний склероз,кардіоміопатія, автоімунний міокардит тощо.Схильність до автоімунних захворювань є успадкованою і контролюється системою гістосумісності (HLA).Лікування автоімунних захворювань базується на проведенні імунодепресивної терапії з використаннямглюкокортикостероїдів, імунодепресантів та елімінації (виведення) автоімунних комплексів із організму шляхом проведенняплазмоферезу.Існує альтернативна теорія виникнення автоімунних захворювань, при якій зрушення пов'язують із змінами у метаболізмі цукрів[2], однак більшість вчених це відкидає і дотримаються традиційних поглядів[3]. 43.Комплексна оцінка імунного статусу організму. Діагностика імунопатологічних станівІмунний статус людини - це клінічний стан організму, а також кількісний та функціональний стан вроджених та адаптивних гуморальних і клітинних факторів імунітету. Стан імунної системи має найважливіше значення в забезпеченні гомеостазу організму, захисту від усього генетично чужорідного. Імунний статус визначає ефективність та узгодженість роботи всіх систем і ланок імунітету - макрофагів, комплементу, інтерферонів, Т-і В-лімфоцитів, головної системи гістосумісності. Показання для дослідження імунного статусу: схильність до хронічних гнійно-септичних, наявність пухлинних захворювань, підозра на імунодефіцит, здорові особи, які будуть працювати в екстримальних (шкідливих) умовах. Для постановки діагнозу імунопатологічного стану проводять збір імунологічного анамнезу та проведення імунологічних тестів. Можуть також здійснюватися тести in vivo (шкірні тести), ретгенологічічне дослідження лімфоїдних органів (тимуса). Принципи оцінки імунного статусу: Двохетапний принцип. Поланковий принцип дослідження імунної системи (фагоцитарна, клітинна, гуморальна ланки) залежно від клінічного прояву імунодефіциту. Для оцінки загального імунного статусу використовують найпростіші і достовірні показники, що відображають сумарну ефективність роботи всіх систем імунітету, для вивчення ураженої ланки - специфічні для кожної системи диференціальні тести.
Серед лабораторних методів, використовуваних в цілях иммунодиагностики, особливе місце займають:
1) методи, засновані на детектуванні клітин і молекул імунної системи за допомогою маркованих моноклональних антитіл (МАТ). В основі цих методів - отримання за допомогою гібридомної технології моноклональних антитіл до конкретних молекулам. Отримані моноклональні антитіла маркують флуорохромами, радіоактивним ізотопом або іншим способом і, використовуючи основну властивість антитіл - здатність зв'язуватися з антигеном, детектируют досліджувані молекули на окремих клітинах, біопсійних зразках тканин або в інших матеріалах. Для детекції зв'язування досліджуваної молекули з МАТ потрібно спеціальної обладнання: якщо МАТ марковане флуорохромами, то реєстрацію результатів здійснюють за допомогою люмінесцентного мікроскопа, але ефективніше - за допомогою проточного лазерного цитофлуориметр. Якщо МАТ марковані радіоактивним ізотопом, то результати реєструють за допомогою лічильників іонізуючого випромінювання, або із застосуванням авторадіографіі. Імуноферментний метод, метод іммуноелектронной мікроскопії, іммуноцітохіміі та імуногістохімії також відносяться до цієї групи методів. Впровадження цієї групи методів дозволило проводити іммунофенотіпірованіе для визначення належності клітин імунної системи до тієї чи іншої субпопуляції, а також проводити якісне та кількісне визначення практично будь-яких білкових молекул і гаптенов. Тому області застосування цієї групи методів далеко переступили межі иммунодиагностики і навіть медицини;
2) серологічний метод. Цей метод також застосовується на основі взаємодії антиген-антитіло, але в разі візуально детектіруемого взаємодії. Тобто в тих випадках, коли взаємодія антигену з антитілом проходить як специфічну, так і неспецифічну фазу, формуючи видимий неозброєним оком макромолекулярний комплекс у вигляді агглютіната або преципітатів (див. лекцію Антитіла). Цей метод переважно використовується для діагностики деяких інфекційних захворювань (для визначення рівня антигенспецифических антитіл або антигенів збудника), для визначення груп крові, а також для визначення С-реактивного білка і деяких інших прозапальних білків, що циркулюють у кровоносному руслі в достатньо високій концентрації. Серологічний метод простий, не вимагає спеціального обладнання, але поступається попередній групі методів в точності, відтворюваності, специфічності і роздільної здатності, тому поступово втрачає своє значення;
3) молекулярно-генетичні методи (полімеразна ланцюгова реакція - ПЛР, метод молекулярної гібридизації з використанням ДНК-, РНК-зондів, реакція секвенцірованія). В основі цих методів - дослідження окремих генів, детекція мутацій. Молекулярно-генетичні методи застосовують для підтвердження первинних (вроджених) імунодефіцитів, для визначення гаплотипу головного комплексу гістосумісності при виявленні ризику розвитку аутоімунних процесів, для виявлення в біологічному матеріалі геному мікроорганізмів та ін;
4) культурально-біологічні методи. Це також велика група методів, що припускають застосування в якості допоміжних реагентів клітин тварин (еритроцитів барана, наприклад), мікроорганізмів (для визначення фагоцитарної активності часто використовуються стафілококи, кандиди). Крім цього в процесі проведення дослідження застосовується культивування клітин імунної системи в лабораторних умовах. Зазвичай ця група методів застосовується для оцінки функціональної активності клітин імунної системи. 44.Вакцини. Історіяодержання. Класифікація вакцин. Корпускулярні, хімічні, синтетичні, генноінженерні та ідіотиповівакцини Вакцини (Vaccines) - препарати, призначені для створення активного імунітету в організмі щеплених людей чи тварин. Основним діючим початком кожної вакцини є іммуноген, тобто корпускулярна чи розчинена субстанція, що несе на собі хімічні структури, аналогічні компонентам збудника захворювання, відповідальним за вироблення імунітету.Історію створенні засобів специфічної профілактики можна розділити втричі періоду:1.Бессознательние спроби біля підніжжя наукової медицини штучно заражати здорових покупців, безліч тварин виділеннями від хворих на легкої формою захворювання.2. Створення великої кількості вакцин з убитих бактерій.3. Створення й застосування їх живих, убитих, субодиничних вакцин.Розрізняють такі види вакцин:Вакцина адсорбированная (v.adsorptum) - У., антигени якоїсорбировани на речовинах, посилюючих іпролонгирующихантигенное роздратування.Вакцина антирабическая (v.antirabicum; анти- + латів.rabies сказ) - У., виготовлена з штами фіксованого вірусу сказу в суспензії тканин мозку тварин чи культурі клітин та призначена попередження захворювання в осіб, покусаних (>ослюненних) тваринами, хворими сказом (підозрюваними на захворювання).Вакцина асоційована (v.associatum; сін.: У. комбінована, У. комплексна,поливакцина) - препарат, що з кількох У. різних типів, готовий до одночасної імунізації проти кількох інфекційних захворювань.Вакцина жива (v.vivum) - B., яка містить життєздатні штами патогенного мікроорганізму, ослаблені до ступеня, яка виключає виникнення захворювання, але цілком зберегли антигенні властивості, що зумовлюють формування специфічного імунітету у щепленого.Вакцина поливалентная (v.polyvalens; грецьк.poly - багато + латів.valens,valentis сильний) - У., виготовлена з урахуванням кількох сіркологічних варіантів збудника однієї інфекційної хвороби.Вакцина убита (v.inactivatum) - У., виготовлена з мікроорганізмівинактивированних (убитих) впливом фізичних чи хімічних чинників.Корпускулярні вакцини — це бактерії, віруси, інактивовані хімічним (формалін, спирт, фенол) чи фізичним (тепло, ультрафіолетове опромінення) впливом. Прикладами корпускулярних вакцин є: коклюшна (як компонент АКДС і Тетракок), антирабічна, лептоспірозна, грипозні цельновіріонні, вакцини проти енцефаліту, проти гепатиту А (Аваксим), інактивована поліовакцина.Хімічні вакцини містять компоненти клітинної стінки чи інших частин збудника, як, наприклад, в ацеллюлярній вакцині проти коклюшу, коньюгированной вакцині проти гемофільної інфекції чи у вакцині проти менінгококкової інфекції.Біосинтетичні вакцини — це вакцини, отримані методами генної інженерії які є штучно створеними антигенними детермінантами мікроорганізмів. Прикладом може служити рекомбінантна вакцина проти вірусного гепатиту B, вакцина проти ротавірусної інфекції. Для їхнього одержання використовують дріжджеві клітини в які вбудовують вирізаний ген, що кодує вироблення необхідного для одержання вакцини протеїну, що потім виділяється в чистому вигляді.Векторні (рекомбінантні) вакцини — вакцини, отримані методами генної інженерії. Суть методу: гени вірулентного мікроорганізму, що відповідальний за синтез протективних антигенів, вбудовують у геном непатогенного мікроорганізму, що при культивуванні продукує і накопичує відповідний антигенРекомбинантні вакцини — для виробництва цих вакцин застосовують рекомбінантну технологію, вбудовуючи генетичний матеріал мікроорганізму в дріжджові клітки, які продукують антиген. Після культивування дріжджів з них виділяють потрібний антиген, очищають і готують вакцину. Прикладом таких вакцин може служити вакцина проти гепатиту В 45.Живі вакцини, принципи одержання. Контроль, практичне використання живих вакцин,оцінка ефективності. Живі вакцини, принципи одержання. Практичне використання та оцінка ефективності. Біологічні препарати виготовленні з живих бактерій або вірусів з пониженою вірулентністю, але вираженими імуногенними в-ми.Індукують довготривалий і напружений поствакцинальний імунітет, є найбільш ефективними.
Для виготовлення використовують «атенуацію» - зниження вірулентності, шляхом несприятливих умов культивування, селекцію найменш вірулентних штамів.
Їх важко зберігати, стандартизувати,контролювати активність. У людей зі слабким імунітетом живі вакцини можуть викликати зах-ня. Відносяться: вакцини проти тубер.(БЦЖ),кору, жовтої гарячки,поліомієліту, сказу, віспи та інш.Живі атенуйовані вакциниЇх виготовляють з атенуйованих слабовірулентних штамів бактерій або вірусів, які не здатні викликати захворювання, але їх залишкова вірулентність дає змогу розмножуватися в організмі щепленої тварини, викликає доброякісний інфекційний процес, у результаті якого в організмі виробляються специфічні антитіла.Атенуйовані штами одержують відбиранням спонтанних мутантів, або ж штучним послабленням вірулентності мікроорганізмів при пасажах на інших видах тварин чи курячих ембріонах, вирощуванні на нехарактерних для мікроорганізму поживних середовищах, при дії фізичних (температура, ультрафіолетове, рентгенівське та гамма-опромінення) і хімічних факторів. Одержані мутанти повинні стійко передавати свої властивості за спадковістю. Наприклад, вакцина СТІ проти сибірки виготовлена із варіанта вірулентного штаму, який втратив властивість утворювати захисну капсулу в організмі (Гінсбург Н. Н., 1924), що призвело до різкого зниження вірулентності цього препарату.Завдяки залишковій вірулентності, властивості розмножуватися в організмі, живі вакцини мають виражену імуногенність, імунітет розвивається протягом кількох днів, має високу напругу і на тривалий період; вакцину вводять одноразово, в невеликій кількості.Недоліки живих вакцин- можливі ускладнення в ослаблених тварин внаслідок залишкової вірулентності;- робота з живими вакцинами потребує великої обережності, щоб не допустити поширення вакцинного штаму у зовнішньому середовищі;- за один – два дні до вакцинації, і протягом тижня після вакцинації не можна давати тваринам лікарських речовин, які б діяли на вакцинний штам;- при розчиненні й застосуванні вакцини слід обережно використовувати дезречовини.Контроль живих вакцинНа: - стерильність (вірусні), чистоту й типовість росту (бактеріальні вакцини) – висівом на поживні середовища;- нешкідливість – введенням лабораторним тваринам;- активність (імуногенність) – вакцинацією тварин із подальшим їх зараженням польовим штамом.Живі (неослаблені) вакциниЦі вакцини були першими, які використовували з метою профілактики інфекційних захворювань у тварин (Віспа, перипневмонія великої рогатої худоби), хоч їх збудники ще не були відкриті. У цьому разі використовували вірулентні штами, які вводили несприйнятливому до них виду (наприклад, збудником віспи корів щепили овець), або ж вводили його у кінчик хвоста (у так звану (Заборонену ділянку)), звідки він поширювався по організму. 46.Хімічні вакцини і анатоксини, принципи одержання. Асоційовані вакцини. Адсорбовані вакцини, принцип «депо» вакцини. Хімічні вакцини є вакцинами другого покоління. Такі вакцини містять уже очищені антигени збудників інфекційних захворювань,отримані переважно хімічними методами. Основний принцип одержання хімічних вакцин полягає у виділенні та очищенні проективних антигенів від баластних речовин,які забезпечують розвиток надійного імунітету. Для виділення з мікроорганізмів антигенних комплексів використовують трихлороцтову кислоту,фенол,ферменти тощо. Хімічні вакцини характеризуються слабкою реактогенністю,вони є генетично і онкогенно безпечними,стійкими до впливу зовнішнього середовища,можуть використовуватися у різних асоціаціях. Але недоліками хімічних вакцин є те,що вони швидко виводяться з організму і є менш імуногенними.Анатоксини-якісно нові препарати,одержані з екзотоксинів бактерій шляхом обробки 0,4% розчином формаліну при 37*С протягом 3-4 тижнів. Така технологія зберігає антигенні та імуногенні властивості екзотоксинів,але знищує їх токсичність. На введення анатоксинів організм виробляє антитоксини. Для досягнення напруженого антитоксичного імунітету необхідне дворазове введення анатоксину з подальшою ревакцинацією.Сьогодні широко використовують анатоксини,до складу яких після очищення і концентрації додають сорбенти-ад’юванти. Такі вакцини називаються адсорбованими. Адсорбція анатоксинів значно підвищує їх імуногенні властивості.Вакцини різних типів, що містять кілька компонентів називаються асоційованими вакцинами. Ці препарати, призначені для одночасної вакцинації проти декількох інфекційних захворювань.Для підвищення імуногенності антигенів, які входять до складу інактивованих, хімічних, синтетичних В. і анатоксинів, застосовують ад’юванти. Ад’юванти (лат. adjuvans — допомагаю) — це різноманітні за походженням і фізико-хімічними властивостями речовини: гель гідроокису алюмінію, ліпіди, емульгатори, полімерні сполуки). Механізм дії ад’ювантів полягає у створенні «депо» антигену в місці введення В. та неспецифічної стимуляції функціональної активності імунокомпетентних клітин. 47.Анатоксини, їх одержання, очищення, одиниці виміру, використання, оцінка. Анатоксини-якісно нові препарати,одержані з екзотоксинів бактерій шляхом обробки 0,4% розчином формаліну при 37*С протягом 3-4 тижнів. Така технологія зберігає антигенні та імуногенні властивості екзотоксинів,але знищує їх токсичність. На введення анатоксинів організм виробляє антитоксини. Для досягнення напруженого антитоксичного імунітету необхідне дворазове введення анатоксину з подал’ьшою ревакцинацією.Важливою особливістю цих препаратів є також те,що вони забезпечують збереження стійкої імунологічної пам’яті. Проте ці препарати швидко виводяться з організму і не запобігають бактеріоносійству токсигенних штамів в імунізованих колективах. Активність визначають реакції преципітації при зв’язуванні анатоксину зі специфічним антитоксином і виражають у флокуляційних одиницях за Рамоном.Сьогодні у практиці використовують ботулічний,гангренозний,дифтерійний,стафілококовий та деякі інші анатоксини. 48.Корпускулярні вакцини з убитих мікробів. Принципи одержання, контроль, оцінка ефективності. Корпускулярні вакцини з убитих мікробів називаються інактивованими вакцинами і відносяться до вакцин першого покоління. Для того щоб одержати такі вакцини проводять відбір вірулентних штамів бактерій чи вірусів,які мають повний набір необхідних антигенів та інактивують їх. Для інактивації використовують фізичні і хімічні методи(обробка формаліном,ацетоном,спиртом). Переваги:можливість добору високо антигенних штамів мікроорганізмів;зручне дозування;відсутність впливу на генетичний апарат;неможлива реверсія вірулентності.Недоліки:слабший(порівняно з живими) імунітет;парентеральне введення;значна к-сть баластних речовин,які можуть стати причиною алергічних реакцій.(більш нічо не найшла,мо хто найде,допишіть) 49 Імунні сироватки. Призначення, склад, принцип одержанняСИРОВАТКИ ІМУННІ — матеріальна частина гуморального імунітету, протекторний ефект якого принципово пов’язаний із специфічним комплексоутворенням між антигеном та антитілом. За основним біологічним призначенням сироватки поділяються на два види: лікувально-профілактичні та діагностичні. С.і. лікувально-профілактичні — сироватки крові тварин і людини, що містять антитіла проти бактерій (антибактеріальні), вірусів (противірусні), екзотоксинів (антитоксичні), отрут змій, павуків та ін. Готують із крові гіперімунізованих тварин (зазвичай коней, мулів, буйволів), здорових людей, які в минулому перенесли інфекційне захворювання (у крові таких людей є антитіла проти його збудника), або спеціально імунізованих людей-донорів. Використовують для лікування й попередження інфекційних захворювань та токсикозів (дифтерія, правець, ботулізм, анаеробна газова інфекція, віспа, краснуха, грип, сказ, укус змій, отруйних павуків та ін.). Уводять підігрітими до температури тіла в/м, рідше — підшкірно; спеціальні препарати можна використовувати в/в. Перед уведенням сироваткові препарати оглядають. У нормі вони є рідиною прозорого або опалесцентно-жовтуватого кольору. Сироватки, що містять осад, пластівці, частки, куски скла, не мають етикеток, із закінченим терміном непридатні до застосування. С.і. можуть мати побічні ефекти. С.і. діагностичні (діагностичні антисироватки) — містять антитіла проти одного (моновалентні, моноспецифічні) або декількох (полівалентні, поліспецифічні) антигенів. Для отримання імунної діагностичної сироватки імунізують кроліків повноцінними антигенами. Технологія їх виготовлення залежить від типу сироваток (аглютинувальні, преципітувальні, імунофлуоресцентні та ін.) і виду антигенів. С.і. діагностичні використовують для ідентифікації збудників, як тест-сироватки в серологічних реакціях для визначення груп крові та ін. С.і. також використовуються з метою лікування (серотерапія) та профілактики (серопрофілактика) інфекційних захворювань. 50 нема,стоїть як назва розділу51Особливості біології вірусівВіруси (Від лат. virus — отрута) — неклітинні форми живих організмів[1], які складаються з нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) і білкової оболонки, зрідка включаючи інші компоненти (ферменти, ліпідні оболонки тощо). Віруси займають екологічну нішу облігатних внутрішньоклітинних паразитів, розмножуючись тільки в живих клітинах, вони використовують їхній ферментативний апарат і переключають клітину на синтез зрілих вірусних часток —віріонів. Поширені всюди. Викликають хвороби рослин, тварин і людини. Існує декілька механізмів антивірусного захисту організму людини. Один із них — синтез інтерферону, протеїну, що бере участь в блокуванні розповсюдження вірусної інфекції між сусідніми клітинами. Розділ біології, що вивчає віруси називається вірусологієюТе, чи можна віруси вважати живими, залежить від прийнятого визначення життя. Зазвичай віруси вважаються живими за «функціональним» визначенням життя, проте не за «структурним».Функціональне означення життя полягає у формуванні списку аксіом, які не відштовхуються від його структури, які мусить виконувати кожен організм, щоб його можна було визнати живим. Він повинен (одна з можливих аксіоматизацій, хоча усі вони означають приблизно те саме):-бути здатним до розмноження;-виказувати спадкову мінливість, яка впливає на можливості розмноження, тобто бути здатним до еволюції.Отже кристали, пріони чи комп'ютерні віруси, хоча й здатні розмножуватися, не володіють жодними істотними спадковими рисами, отже не є живими. Біологічні віруси згідно з цим визначенням, є живими.Структурне визначення життя полягає у встановленні списку критеріїв, які відштовхуються від структури організму. Це, між іншим:розмноження,ріст,обмін речовин,клітинна будова, з рибосомами та іншими органелами,генетичний матеріал, який зберігається у вигляді нуклеїнових кислот,наявність білка і нуклеїнових кислот,РухНа відміну від функціонального визначення, тут не має визначеного набору умов, у більшості таких наборів віруси не задовольняють принаймні одну з таких умов. 52. Місце вірусів серед автономних генетичних систем (віроїди, транспозони, плазміди). Віруси бактерій (бактеріофаги) Окрім класичних вірусів, які представлені віріонами, існують вірусоподібні структури: плазміди, віроїди і пріони. Плазміди (син.: епісоми, епівіруси) паразитують у цитоплазмі бактерій. На відміну від вірусів, вони не мають білкової оболонки, а складаються лише з молекули кільцевої дволанцюгової ДНК, розміри якої становлять 1 — 3 % розміру геному бактерії. Кількість плазмід в одній бактеріальній клітині коливається від 1 до 10 і більше. Гени плазмід кодують різні білки, які не є їхнім структурним компонентом, а виконують різні функції, як правило, корисні для бактеріальної клітини. Так, К-плазміди кодують синтез ферментів, які руйнують антибіотики, що зумовлює стійкість бактерій до лікарських препаратів. У Вас. anthracis капсульний антиген і токсин кодуються плазмідами; відсутність одного з них або обох робить бацили авірулентними. Плазміди не здатні самостійно розмножуватися. їхня реплікація здійснюється за участю ферментів бактеріальної клітини. Не виключається наявність у плазмід власної системи реплікації, проте її функціонування залежить від метаболічної активності бактерії. Плазміди можуть вбудуватися в клітинний геном і довготривало перебувати в інтегрованому стані, реплікуючись синхронно з хромосомою. Вони зумовлюють нестабільність генетичних ознак у бактерій. Плазміди виявлено також у дріжджів і плісеневих грибів. У вигляді плазмід можуть існувати деякі віруси тварин, наприклад вірус папіломи корів з родини Раріїїотауігісіае або мавпячий вірус 40 з родини Роїуотауігісіае. Ще більш своєрідними вірусоподібними структурами є віроїди — збудники інфекційних хвороб рослин (хризантем, цитрусових, огірків, томатів, картоплі). Як і плазміди, віроїди не мають білкової оболонки, складаються тільки з молекули кільцевої одноланцюгової РНК, яка не кодує жодних білків. Реплікація віроїдів відбувається за участю ферментів рослинної клітини. І, нарешті, зовсім незвичайними є пріони — збудники трансмі- сивних губкоподібних енцефалопатій тварин і людини, що характерризуються прогресуючим руйнуванням нервових клітин, внаслідок чого головний мозок набуває губчастої структури. Транспозони (англ. transposable element, transposon) — це ділянки ДНК організмів, що здатні до пересування (транспозиції) та розмноження в межах геному[1]. Транспозони також відомі під назвою «стрибаючі гени» і є прикладамимобільних генетичних елементів.Транспозони формально належать до так званої некодуючої частини геному — тієї, що в послідовності пар основ ДНК не несе інформацію про амінокислотні послідовності білків, хоча деякі класи мобільних елементів містять у своїй послідовності інформацію про ферменти, що транскрибуються та каталізують пересування, наприклад, ДНК-транспозони та LINE-1 кодують білки транспозазу, ORF1p й ORF2p. У різних видів транспозони розповсюджені різною мірою, так у людини транспозони складають до 45% всієї послідовності ДНК, у плодової мухи Drosophila melanogaster частина мобільних елементів становить лише 15-20% усього геному[2]. У рослин транспозони можуть займати основну частину геному, так укукурудзи (Zea mays) з розміром геному у 2,3 мільярдів пар основ принаймні 85% складають різні мобільні елементи 53. Структура віріону. Прості та складні віруси. Будова бактеріофагівПрості віруси. Віріон простих вірусів складається з нук-леїнової кислоти та білкової оболонки – капсиду. Капсид скла-дається з окремих одиниць – капсомерів. Є два способи складання капсомерів: спіральний і кубічний. Це зумовлює відповідний тип симетрії і форму вірусу. Є три типи симетрії: 1) спіральний; 2) кубічний; 3) змішаний, або комбінований. При спіральному типі симетрії капсомери розміщені за ходом спіралі геномної нуклеїнової кислоти. Капсид краще за-хищає геном, а нуклеїнова кислота вивільняється лише при руйнуванні капсиду. Такі віруси мають паличкоподібну форму (наприклад, вірус мозаїчної хвороби тютюну).
При кубічному типі симетрії нуклеїнова кислота утворює серцевинну структуру, оточену капсидом у вигляді багато-гранника (вивільнення нуклеїнової кислоти відбувається без руйнування капсиду). Такі віруси мають сферичну форму (на-приклад, вірус поліомієліту).
У деяких вірусів спостерігається змішаний тип симетрії. У фагів головка має кубічний тип симетрії, а хвіст – спіраль-ний. Такі віруси мають форму сперматозоїда.
Складні віруси. Нуклеокапсид у них укритий ще одні-єю оболонкою – суперкапсидом. Суперкапсид утворений мо-дифікованими (зміненими) мембранами клітин хазяїна, у яких білки хазяїна замінені на білки вірусу (глікопротеїди). Тому суперкапсид містить компоненти, властиві клітинам хазяїна, і вірусні глікопротеїди. Ці глікопротеїди утворюють шипи. Шипи забезпечують адгезію вірусу на чутливих клітинах, обумовлюють його антигенні властивості. Крім того, вони сприяють поширенню вірусів.
Незалежно від способу складання нуклеокапсиду складні віруси (грипу, гепатиту В, ВІЛ) здебільшого мають сферичну форму. Віруси спричинюють близько 500 захворювань: гер-пес, вітряну та натуральну віспу, кір, краснуху, епідемічний паротит, гепатит, грип, сказ, СНІД, онкологічні захворювання та ін. Віруси руйнуються під впливом лугів, хлораміну та хлор-ного вапна, але стійкі до дії антибіотиків. Бактеріофаги — це віруси, що мають здатність проникати в бактеріальні клітини, репродуктіроваться в них і викликати їх лізис.Бактеріофаги складаються з голівки округлої гексагональної або палочковидної форми діаметром 45—140 нм і відростка завтовшки 10—40 і завдовжки 100—200 нм.(деякі не мають відростка). Голівка бактеріофага складається переважно з дезоксирибону клейнової кислоти (ДНК) (довжина її нитки у багато разів перевищує розмір голівки і досягає 60—70 мкм, ця нитка щільно скручена в голівці) або рибонуклеїновою кислоти (РНК) і невеликої кількості (близько 3%) білка і деяких інших речовин. Відросток бактеріофага має вигляд порожнистої трубки, оточеної чохлом, що містить скоротливі білки, подібні мишечним. В ряду Б. чохол здатний скорочуватися, оголюючи частину стрижня. На кінці відростка є базальна пластинка з декількома шиловидними або інші форми виступами. Від пластинки відходять тонкі довгі нитки, які сприяють прикріпленню фага до бактерії. Оболонки голівки і відростка бактеріофага складаються з білків. Загальна кількість білка в частці фага 50—60%, нуклеїнових кислот — 40—50%. Кожен Би. володіє специфічними антигенними властивостями, відмінними від антигенів бактерії-господаря і інших фагов. Є антигени, загальні для ряду фагов (що особливо містять РНК(рибонуклеїнова кислота). Субодиниці капсйду називають капсомерами. Структурні елементи складних відростків дістали назву зовнішнього чохла, внутрішнього стрижі ня і базальної пластинки, відростка з зубцями і нитками. 54. Вірусні білки. Структурні та неструктурні білки. Ферменти віріону та вірус індуковані ферменти Білки вірусів можуть бути поділені на структурні, що входять до складу віріону, і неструктурні, що виявляються в зараженій клітині під час вірусної інфекції, але не входять до складу віріону. Неструктурні білки забезпечують внутрішньоклітинну репродукцію вірусів на різних етапах.Структурні білки формують структуру віріону. Їх кількість може бути від 2 - 3 у простих вірусів до 100 і більше у складноорганізованих вірусів віспи. Капсид може містити також низку ферментів і регуляторних білків, пов'язаних у віріоні з вірусним геномом, а в зараженій клітині – з нуклеїновими кислотами, що беруть участь в реплікації. Основною функцією власне капсидних білків є захист геному вірусу від зовнішнього впливу. Багато які вірусні структурні білки містять “масковану" N-кінцеву аміногрупу, представлену ацетильованим серином, тобто в цьому випадку має місце “маскування" вільної NH2-групи шляхом її ацетилювання. “Маскування" N-кінцевої амінокислоти і заміна З-кінцевої амінокислоти на треонін мабуть є еволюційним пристосуванням, що ускладнює руйнування вірусних білків протеазами клітини-господарі.Суперкапсидні білки розміщуються в ліпопротеїдній оболонці складних оболонкових вірусів. За своєю структурою ці білки подібні до білків плазматичної мембрани клітини. Звичайно білки пеплоса представлено глікопротеїдами, вуглеводні ланцюжки яких прикріплені до певних амінокислот поліпептиду. Вуглеводи захищають білковий скелет вірусної оболонки від протеаз клітини-господаря і впливають на антигенні властивості вірусних білків.У оболонкових вірусів глікопротеїди звичайно утворюють на поверхні вірусної частки шпички, що беруть участь в адсорбції вірусу на клітинній мембрані і проникненні його в клітину. Глікопротеїди є основними антигенами, до яких утворюються вірус-нейтралізуючі антитіла. Ці білки використовують у практиці для отримання противірусних вакцин.Неструктурні білки вивчено значно менше, ніж структурні, через складність їх очищення та ідентифікації. До неструктурних білків відносяться ферменти, що забезпечують транскрипцію і реплікацію вірусного геному, білки-регулятори.Ліпіди у складних вірусів виявляються лише в складі липопротеїдної оболонки.Багато які структурні білки віріону мають ферментативну активність, котра забезпечує адсорбцію і проникнення вірусу в клітину, транскрипцію і трансляцію вірусного геному і вивільнення зрілого вірусу з клітини. Кількість таких ферментів у різних вірусів неоднакова. Найпростіші віруси (поліомієліту, гепатиту А) взагалі не містять в складі віріону ферментів, а у вірусів групи віспи (натуральної віспи людини, віспи корів) виявлено більш ніж півтора десятка різних ферментів. Деякі віруси людини і тварин (зокрема, що належать до родиниRetroviridae - вірус імунодефіциту людини) володіють зворотньою транскриптазою - РНК-залежною ДНК-полімеразою, здатною синтезувати ДНК на матриці РНК.У віріонах РНК-геномних вірусів, що мають мінус-РНК, обов'язковою є присутність власної РНК-полімерази, що здійснює транскрипцію віріонної РНК і синтез вірусспецифічних іРНК. Такий фермент знайдено у представників родин Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae та ін.Високоочищені препарати віріонів містять низку низькомолекулярних компонентів - поліамінів і, в скорочувальному чохлі відростка бактеріофагів, іони Са2+. 55Вірусні нуклеїнові кислоти. Вірусні ДНК. Вірусні РНК плюс- та мінус-типу Клітини всіх живих організмів містять два типи нуклеїнових кисні ДНК і РНК. Вони побудовані з чотирьох типів нуклеотидів, які, з»єднуючись між собою, утворюють довгі полінуклеотидні ланцюги (нитки). До складу нуклеотидів входять залишки азотистої основи (аденін, гуанін, цитозин, тимін у ДНК і урацил у РНК) і фосфорпої кислоти. Первинну структуру нуклеїнових кислот досить міцно стабілізують ковалентні зв'язки, а саме: глікозидний зв'язок між азотистою основою й вуглеводним компонентом, ефірний зв'язок між дезоксирибозою або рибозою і фосфорною кислотою та фосфодиефірний зв'язок між нуклеотидами. Клітинна ДНК -— це двонитчаста молекула, в якій полінуклео- ні ланцюги з'єднані водневими зв'язками, що утворюються між азотистими основами згідно з законом комплементарності (аденін - тимін, гуанін - цитозин). Двонитчаста ДНК — це клітинний геном, який виконує функції збереження і реплікації спадкової інформації. Лише одна нитка ДНК кодувальна, тобто несе генетичну інформацію про білки. Обидві нитки ДНК слугують матрицею для реплікації і синтезу точних копій клітинного геному. Клітинна РНК є однонитчастою молекулою, яка представлена різними класами: 1 -інформаційні РНК (іРНК) утворюються в результаті транскрипції геному і передають генетичну інформацію на білок- синтезуваль ний апарат клітини; 2 - рибосомальні РНК (рРНК) є структурним елементом рибосом; 3 - транспртні РНК (тРНК) доставляють амінокислоти до рибосом. На відміну від від клітинних форм життя, в складі віріонів вірусів є лише один тип нуклеїнової кислоти — ДНК чи РНК.Віруси поділяються на ДНК-вмісні (або ДНК-геномні) та РНК-вмісні (або РНК-геномнї). Вірусна РНК, так само як і ДНК, є носієм генетичної інформації, причому більшість вірусів тварин і людини РНК-геномні. вірусний геном гаплоїдний, за винятком ретровірусів, які мають диплоїдний геном, представлений 2 ідентичними молекулами одноланцюгової РНК. Молекулярна маса вірусних нуклеїнових кислот коливається в широких межах: у ДНК-вмісних вірусів від 1,5 х 106 Д (парвовіруси) до 250 х 106 Д (покс- та іридовіруси); у РНК-вмісних вірусів — від 2,5 х 106 Д (пікорнавіруси) до 20 х 106 Д (реовіруси). Вірусні нуклеїнові кислоти характеризуються надзвичайною різноманітністю форм. Вірусні ДНК увають одно- і дволанцюгові, лінійні та кільцеві. У вірусних дволанцюгова ДНУ характеризується тим, що генетична інформація закодована на обох ланцюгах. Структура ДНК в основному унікальна: більшість нуклеотидних послідовностей трапляється лише один раз. Але на кінцях молекул бувають повтори, коли в кінцевому фрагменті ДНК дублюється її початкова ділянка. Повтори можуть бути прямими та інвертованими— з нуклеотидними послідовностями у зворотному порядку, які здатні утворювати шпилькові структури. У цих повторах закладена потенційна здатність до утворення кільцевої форми, яка має велике значення для вірусів. По-перше, кільцева форма забезпечує стійкість нуклеїнової кислоти до нуклеаз — ферментів, які послідовно відщеплюють нуклеотиди з кінців полінуклеотидного ланцюга. По- друге, стадія утворення кільцевої форми є обов'язковою для процесу інтеграції вірусної ДНК із клітинним геномом. І, нарешті, кільцева форма — це зручний та ефективний спосіб регулювання транскрипції й реплікації ДНК. Кільцеву дволанцюгову ДНК мають папілома-, по- ліома- і гепаднавіруси. В інших вірусів двонитчасті ДНК набувають кільцевої конфігурації тимчасово, ймовірніше — під час реплікації. ДНК багатьох вірусів має деякі специфічні особливості. Так, ДНК папілома- й поліомавірусів надспіралізована і за своєю конфігурацією подібна до хромосоми клітини. У гепаднавірусів плюс- нитка ДНК дефектна — на 15-60 % коротша за мінус-нитку. У поксвірусів обидва ланцюги ДНК ковалентно замкнені на кінцях. Одноланцюгова ДНК характерна для парво- та цирковірусів. У вкладі віріонів цирковірусів, як правило, міститься ДНК однієї полярності (мінус-нитка). Геном автономних парвовірусів також пред-ставлений в основному мінус-нитчастою ДНК, хоч у частини віріонів (1-50 %) виявляють плюс-нитки. ДНК обох полярностей міс- тять, нарвовіруси комах і аденоасоційовані віруси, які є дефектними і здатні розмножуватися лише в присутності вірусу-помічника. При дезінтеграції віріонів плюс- і мінус-нитки ДНК можуть взаємодіяти між собою, утворюючи дволанцюгову ДНК. Вірусні РНК, так само, як і клітинні, дуже різноманітні. Вони бувають одно- і двонитчастими, лінійними, фрагментованими і кільцевими. Для однонитчастої РНК характерна полярність. Віруси, що містять-одноланцюгову РНК, поділяються на дві групи: плюс- нитчасті (віруси з позитивним геномом) і мінус-нитчасті (або віруси з негативним геномом). У плюс-нитчастих вірусів віріонна РНК виконує функцію іРНК, тобто здатна безпосередньо переносити генетичну інформацію на рибосоми. Позитивний геном мають пікорна-, тога-, флаві-, артері-, корона-, каліци-, нода- й астровіруси. Плюснитчастими є також ретровіруси, але вони реалізують свою генетичну інформацію через комплементарну ДНК-копію. У мінус- нитчастих вірусів віріонна РНК не має властивостей іРНК. У таких вірусів на матриці мінус-нитки РНК синтезується комплементарна їй іРНК за участю вірусного ферменту транскриптази, який обов'язково входить до складу віріонів. Негативний геном мають парамік- ортоміксо-, рабдо-, філо-, борна- арена- і буньявіруси, причому в арена- і буньявірусів частина генів із позитивною полярністю. Одпонитчаста РНК в ортоміксовірусів є фрагментованою (7-8 фрагментів). Арена- і буньявіруси також містять однонитчасту фрагментовану РНК (відповідно 2 і 3 фрагменти). У буньявірусів кожен фрагмент має кільцеву форму, а в аренавірусів фрагментована РНК може бути як лінійною, так і кільцевою. Для дволанцюгової РНК характерна фрагментованість. Цей тип нуклеїнової кислоти властивий реовірусам (10-12 фрагментів) і бірнавірусам (2 фрагменти). Нуклеїнові кислоти зумовлюють інфекційні властивості вірусів. Немало вірусних нуклеїнових кислот інфекційні самі по собі, тобто вони здатні спричинити інфекційний процес за відсутності вірусоспецифічних білків (ферментів). Інфекційні властивості виявляють нуклеїнові кислоти більшості ДНК-вмісних вірусів (за винятком покс-, іридо-, асфар- і гепаднавірусів) і плюс-нитчастих РНК-вмісних вірусів (окрім ретровірусів). Генетична інформація інфекційної ДНК переписується на іРНК за участю клітинної транскриптази, а плюс-нитчаста РНК здатна безпосередньо переносити генетичну інформацію на рибосоми. Інфекційні властивості не виявляють мінус-нитчасті та дволанцюгові РНК. Для експресії неінфекційних вірусних нуклеїнових кислот потрібні вірусоспецифічні ферменти, які знаходяться в складі віріонів. На відміну від цільних віріонів, що здатні уражати конкретні види організмів і репродукуватися лише в певних типах їхніх клітин, інфекційними вірусними нуклеїновими кислотами можна заразити в експерименті лінії клітин і навіть види тварин, нечутливі до даного вірусу в природних умовах. Проте інфекційність вірусних нуклеїнових кислот значно нижча, ніж цільних віріонів.

54.Білки вірусів можуть бути розділені на структурні, вхідні до складу віріона і неструктурні, що виявляються в зараженій клітці під час вірусної інфекції, але не входять до складу віріону. Неструктурні білки забезпечують внутрішньоклітинну репродукцію вірусів на різних етапах.

Структурні білки формують структуру віріону. Їхня кількість може бути від 2 - 3 у простих вірусів до 100 і більше в складноорганизованих вірусів віспи. Капсид може містити також ряд ферментів, а також регуляторних білків, зв'язаних у віріоні з вірусним геномом, а в зараженій клітині беруть участь у реплікації нуклеїнових кислот.

Основною функцією власне капсидних білків є захист генома вірусу від зовнішніх впливів. Багато вірусних структурних білків містять “масковану” N-кінцеву аміногрупу, представлену ацетильованим серином, тобто в даному випадку має місце “маскування” вільної NH₂ групи шляхом її ацетилування. “Маскування” N-кінцевої амінокислоти і заміна З-кінцевої амінокислоти на треонін очевидно є еволюційним пристосуванням, що утрудняє руйнування вірусного білка під дією протеаз клітини-хазяїна.

Суперкапсидні білки розміщуються в ліпопротеїдной оболонці складних вірусів, що мають оболонку. За своєю структурою ці білки подібні білкам плазматичної мембрани клітини, і часто кодуються вірусним геномом. Зазвичай білки пеплосу представлені глікопротеїдами, вуглеводні ланцюжки яких прикріплені до визначених амінокислот поліпептиду. Вуглеводи захищають білковий кістяк вірусної оболонки від протеаз клітини-хазяїна і формують антигенні властивості вірусних білків.

У вірусів, що мають оболонку, глікопротеїди звичайно утворюють на поверхні вірусної частки шпичаки, що беруть участь в адсорбції вірусу на клітинній мембрані і проникненні його в клітину. Глікопротеїди є основними антигенами, до яких утворюються вірус-нейтралізуючі антитіла. Ці білки використовують для одержання противірусних вакцин.

Неструктурні білки вивчені значно менше, ніж структурні, через складність їхнього очищення та ідентифікації. До неструктурних білків відносяться ферменти, що забезпечують транскрипцію і реплікацію вірусного геному, білки-регулятори.

Багато структурних білків віріона мають ферментативну активність, що забезпечує адсорбцію і проникнення вірусу в клітину, транскрипцію і трансляцію вірусного геному і вивільнення зрілого вірусу з клітини. Кількість таких ферментів у різних вірусів неоднакова. Найпростіші віруси (поліомиэліта, гепатиту А) узагалі не містять у складі віріона ферментів, а у вірусів групи віспи (натуральної віспи людини, віспи корів) виявлено більш півтора десятків різних ферментів. Деякі віруси людини і тварин (зокрема, що належати до сімейства Retroviridae) володіють зворотної транскриптазой - РНК-залежною ДНК-полимеразою, здатною синтезувати ДНК на матриці РНК.

У віріонах «-«РНК-геномных вірусів обов'язкова присутність власної РНК-полімерази, що здійснює транскрипцію віріонної РНК і синтез вірусоспецифічних і-РНК. Такий фермент знайдений у представників сімейств Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae та ін.

Особливий інтерес представляють ферменти вірусів, що руйнують клітинні стінки бактерій. Бактеріальні клітки з їх твердою полісахаридною оболонкою в неушкодженому стані не дають можливості проникати усередину клітини вірусній нуклеїновій кислоті. Природно, що бактеріофаги повинні мати відповідні засоби впливу на клітинну оболонку. У багатьох фагів, лизуючих Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, деякі види Salmonella, таким засобом є лізоцим, що локалізується в хвостовому відростку бактеріофага. Найбільш добре вивчений лизоция Т-парних фагів (Т-2, Т-4, Т-6). Лізоцими належать до типу эндоацетилмурамідаз, тобто ферментів, гідролизуючих визначені глікозидні зв'язки в пептидогликанах бактеріальних клітин із звільненням цукрів, що редукуються, і ацетилгексозамінів. У результаті взаємодії ферменту з полісахаридним комплексом бактеріальної оболонки в оболонці утвориться локальний отвір, що в нормальних умовах швидко затягується. При високій множинності зараження, коли на клітинній поверхні адсорбуються від декількох десятків до сотень фагів, ушкодження бувають настільки значними, що клітина гине, а весь клітинний вміст виходить назовні. Цей феномен одержав назву «лізису ззовні».Молекулярна вага лізоциму, виділеного з фага Т2, як виявилося дорівнює 20000 і властивості його істотно відрізняються від властивостей лізоциму курячого яйця.

 

Нуклеїнові кислоти віруса

Віруси містять тільки один тип нуклеїнової кислоти, ДНК або РНК, але не обидва типи одночасно. Наприклад, віруси віспи, простого герпесу, Епстайна-Барр - ДНК-містять, а тогавирусов, пікорнавіруси - РНК-містять. Геном вірусної частинки гаплоїдний. Найбільш простий вірусний геном кодує 3-4 білка, найбільш складний - більше 50 полі