Бактеріологічний метод дослідження. Принципи, методи та етапи виділення чистих культур бактерій та їх ідентифікації.

Бактеріологічний метод полягає у виділенні чистої культури збудника (популяції, що містить бактерії одного виду) і ідентифікації цього збудника є основним методом бактеріологічного дослідження
Вивчення властивостей мікроорганізмів у бактеріологічній лабораторії з метою встановлення приналежності до тієї чи іншої систематичної групи (виду, роду) і називається їх ідентифікація.
В цілому бактеріологічний метод дослідження являє собою багатоетапне бактеріологічне дослідження, яке триває 18- 24 годин.Основою бактеріологічного методу є виділення чистої культури збудника, яке відбувається на першому етапі дослідження. Для виділення чистої культури збудника роблять посів взятого матеріалу. Посів робиться, як правило, на щільні живильні середовища, які вибирають виходячи з властивостей передбачуваного збудника.
При бактеріологічному методі застосовують по можливості середовища, на яких росте тільки конкретний вид бактерій - елективні середовища, або середовища, що дозволяють відрізнити передбачуваного збудника від інших мікроорганізмів або по-іншому диференційно-діагностичні середовища.
Наприклад, при бактеріологічної діагностики кишкових інфекцій - середовище Ендо, для виділення дифтерійної палички використовують телуритові середовища, і т. Д. При виділенні умовно-патогенних мікроорганізмів при бактеріологічному методі посів взятого матеріалу здійснюють на універсальні поживні середовища. Прикладом такого середовища може служити кров'яний агар.
Всі маніпуляції, які пов'язані з виділенням бактеріальних культур, проводяться над полум'ям пальника.
При бактеріологічному методі посів матеріалу на живильні середовища здійснюють або скляним або металевим шпателем, або бактеріальної петлею таким чином, щоб знаходяться в досліджуваному матеріалі бактерії розсіяти по поверхні живильного середовища. У результаті такого розсіювання кожна бактеріальна клітина потрапляє на свою ділянку середовища.
При виділенні з патологічного матеріалу чистої культури збудника, який суттєво забруднений сторонньою мікрофлорою, часто користуються біологічним методом виділення чистої культури. Роблять це таким чином: заражають досліджуваним матеріалом чутливих до збудника лабораторних тварин. Ще один приклад біологічного методу - при дослідженні хворого на вміст у мокроті пневмококів, матеріал внутрибрюшинно вводять білим мишам. З їх крові через 4-6 годин отримують чисту культуру пневмокока.
У тому випадку, якщо в результаті бактеріологічного методу дослідження передбачається в досліджуваному матеріалі зміст малої кількості збудника, посів роблять на рідку живильне середовище для його нагромадження, так звану середу збагачення, яка оптимальна для даного мікроорганізму. Далі здійснюють пересівши з рідкого ПС на щільні середовища, розлиті в чашках Петрі. Засіяну збудником середу поміщають в термостат зазвичай при певній температурі, що важливо для бактеріологічного методу.
На другому етапі бактеріологічного методу дослідження проводять вивчення колоній бактерій, які виросли на щільному живильному середовищі і походять від однієї бактеріальної клітини. (колонія і є чистою культурою збудника). Проводять мікроскопічне і макроскопічне дослідження колоній у відбитому та прохідному світлі: неозброєним оком, під малим збільшенням мікроскопа, за допомогою лупи.
Відзначають культуральні властивості колоній: їх форму, величину, колір, характер країв і поверхні, структуру, консистенцію. Далі для приготування мазків використовують частину кожної з намічених колоній. Забарвлюють мазки за Грамом, микроскопируют, визначаючи тинкторіальних (відношення до фарбування) і морфологічні властивості виділеної культури і перевіряючи одночасно її чистоту.
Частину колонії пересівають в пробірки з оптимальною для даного виду середовищем, наприклад, скошеним агаром, з метою накопичення чистої культури для більш повного її вивчення. Пробірки переміщають на 18-24 години в термостат. На другому етапі, крім перерахованих досліджень, нерідко підраховують кількість вирослих колоній.
Це має особливе значення при захворюваннях, викликаних умовно-патогенними мікроорганізмами. При таких захворюваннях судити про провідну роль якого-небудь збудника допустимо лише по його змісту в патологічному матеріалі в досить великій кількості і переважанню цього збудника над іншою флорою.
Для того щоб провести таке дослідження готують послідовні розведення взятого досліджуваного матеріалу, з яких на чашки з живильним середовищем проводять висів, підраховують кількість колоній, що виросли, множать на розведення, з чого визначають вміст мікроорганізмів в матеріалі.
Ідентифікація виділеної чистої культури збудника і визначення для цієї культури чутливості до антибіотиків та інших хіміотерапевтичних препаратів - третій етап бактеріологічестого методу. Ідентифікацію виділеної бактеріальної культури виробляють по тинкторіальними, морфологічним, біохімічним, культуральними, токсигениих, антигенними властивостями.
Першим ділом беруть мазок з культури, що виросла на скошеному агарі, досліджують морфологію бактерій і перевіряють чистоту культури вирослих бактерій. Далі здійснюють посів виділеної чистої культури бактерій на середовища Гіссена. Бажано провести посів і на інші середовища для визначення біохімічних властивостей.
Ферментативні, або біохімічні, властивості бактерій обумовлені ферментами, які беруть участь у розщепленні білків, вуглеводів, що викликають відновлення і окислення різних субстратів.
Причому кожен з видів бактерій виробляє постійний для нього набір ферментів. Найчастіше при вивченні антигенних властивостей використовують реакцію аглютинації на склі.
За допомогою реакції нейтралізації токсину антитоксином in vivo або in vitro визначають токсиноутворювання мікробів. У ряді випадків вивчають і інші фактори вірулентності. Вище перелічені дослідження, які проводяться в бактеріологічній лабораторії, дозволяють визначити рід або вид збудника.
У тому числі для виявлення джерела інфекції, з метою виявлення епідемічної ланцюжка захворювання, здійснюють внутрішньовидову ідентифікацію бактерій. Суть внутрішньовидової ідентифікації бактерій полягає у визначенні фаговари або фаготип, вивченні різних властивостей виділених антигенних бактерій. Процес визначення фаготип називають фаготипування. Фаготипування здійснюють при черевному тифі, стафілококової інфекції, паратиф В.
На чашку з живильним середовищем, яка засіяна за допомогою шпателя виділеної чистої культурою, наносять різні діагностичні фаги по краплині. У випадку, якщо культура чутлива до даного фагу, в результаті бактеріологічного дослідження спостерігаються так звані негативні колонії (бляшки), які виглядають як утворення округлої форми ділянок зруйнованих бактерій. Культура збудника може бути чутлива до декільком чи одній фагам.
У зв'язку з широким розповсюдженням лікарсько-стійких форм бактерій, для призначення раціональної хіміотерапії необхідно визначення антибіотикограми - стійкості або чутливості до хіміотерапевтичних препаратів виділеної чистої культури збудника. Для антибіотикограми використовують або метод паперових дисків, або найбільш точний, але громіздкий метод серійних розведень.
Метод паперових дисків базується на виявленні зони пригнічення розмноження бактерій навколо дисків, які просочені антибіотиками. У разі застосування методу серійних розведень хімічний препарат - антибіотик з рідким живильним середовищем розводять в пробірках, після чого засівають в пробірки однакову кількість бактерій. По відсутності або наявності росту бактерій проводять облік результатів. У результаті бактеріологічного методу дослідження для визначення ідентичності штамів, отримана антибіотикограма може служити і епідеміологічним цілям.
Можуть проводитися повторні дослідження при виявленні бактеріоносійства т. К. Можна не виявити збудника в одній порції матеріалу.
В даний час в сучасному світі існують прискорені методи визначення виду і роду бактерій. Застосовують систему індикаторних папірців - СІБ, що дозволяє через 6-12 годин і без використання великого числа поживних середовищ виділити чисту бактеріальну культуру. Також широко використовують імунофлюоресцентний метод для експрес-діагностики інфекційних хвороб (див. Серологічні дослідження).