Определение чувствительности бактерий к антибиотикам

Критерием чувствительности микроорганизмов к антибиотикам является минимальная концентрация антибиотика, ингибирующая (задерживающая) рост возбудителя при стандартных условиях постановки опыта. При определении лекарственной устойчивости используют чистую культуру возбудителя, выделенную до начала лечения антибиотиками. Изучение чувствительности проводят методом диффузии в агар с применением стандартных дисков или методом серийных разведении в жидких и плотных средах.

Определение чувствительности к антибиотикам методом бумажных дисков основано на диффузии антибиотика в питательную среду Концентрация антибиотиков в дисках подобрана таким образом, чтобы диаметры зон задержки роста стандартных тест-микроорганизмов соответствовали международным стандартам. В 2004 году Госсанэпиднадзором России утверждена новая инструкция определения чувствительности к антибиотикам, учитывающая общепринятые международные стандарты в этой области. Согласно этим рекомендациям для исследования берут 3-5 колоний выделенной чистой культуры, из которых затем готовится клеточная взвесь на физиологическом растворе или бульоне (Мюллер-Хинтона). С помощью оптического стандарта мутности на 0,5 ед. (по МсФарланду), что соответствует 1,5 х 10⁸ КОЕ/мл) клеточная взвесь стандартизируется. Затем стерильным ватным тампоном, смоченным в приготовленной взвеси, исследуемые бактерии засевают в чашке Петри со специальной средой (чаще всего агар Мюллер-Хинтона). Заштриховав всю поверхность агара вначале один раз, её заштриховывают еще дважды, предварительно вращая чашку каждый раз на 60⁰. Стерильным пинцетом на засеянную поверхность помещают на равном расстоянии друг от друга, от краев и центра чашки стандартные бумажные диски, пропитанные растворами различных антибиотиков. Засеянные чашки выдерживают в термостате при температуре, оптимальной для роста исследуемых бактерий. Если бактерии чувствительны к данному антибиотику, то вокруг дисков образуется зона задержки роста. Диаметр зоны задержки роста соответствует степени чувствительности исследуемого микроорганизма к данному антибиотику. Окончательный результат оценивается по специальным таблицам.

Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундируемым в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность методом серийных разведений. Жидкую среду (пригодную для роста данного микроба) разливают по 2 мл в 10 пробирок. Готовят раствор антибиотика, содержащий 100 ед. в 1 мл, и добавляют 2 мл раствора в 1-ую пробирку. После тщательного перемешивания 2 мл переносят в следующую пробирку и т.д. Из 9-ой пробирки 2 мл удаляют. Десятая пробирка не содержит антибиотика и служит контролем. Суточную культуру микроба разводят с использованием стандарта мутности до густоты 10000 микробов в 1 мл. После чего в каждую пробирку вносят по 0,2 мл взвеси. После 20 ч инкубации в термостате учитывают результат. Среда в пробирках, в которых антибиотик находится в концентрациях, достаточных для подавления роста микроорганизмов, остается прозрачной. Наименьшая концентрация антибиотика, при которой размножение микроорганизмов уже не происходит, а содержимое пробирок остается прозрачным, соответствует наименьшей ингибирующей концентрации данного антибиотика в отношении изучаемого микроорганизма и рассматривается как бактериостатическая, что означает задержку роста бактерий, но не наличие их гибели. Для определения бактерицидной концентрации исследуемого антибиотика в отношении изучаемого микроорганизма (т.е. концентрации препарата, в которой он вызывает гибель клеток) проводят посев бактериологической петлей из пробирок (содержимое которых не помутнело) на полноценную питательную агаризованную среду. Отсутствие роста свидетельствует, что в данной пробирке микроорганизмы полностью убиты данным антибиотиком.

Метод Е-тестов (от англ. ellipse- эллипс, т.к. при наличии чувствительности образуется зона задержки роста эллиптической формы) - сочетает в себе достоинства метода серийных разведении и метода дисков. Вместо дисков используются полоски фильтровальной бумаги, пропитанной различными концентрациями антибиотика. Полоски помещают на поверхность питательного агара, засеянного исследуемой культурой. Если бактерии чувствительны к действию данного препарата, вокруг участков полоски, содержащих его ингибирующие концентрации, возникает эллипсовидная зона.

Метод серийных разведении антибиотика в агаризованной среде удобен тем, что позволяет в одном опыте проверить чувствительность к данному антибиотику нескольких микроорганизмов. Разведения антибиотика готовят в стерильной агаризованной среде. Для этого в нее добавляют требуемое количество исходного раствора антибиотика, тщательно перемешивают и заливают в стерильные чашки Петри. После застывания агара дно чашки с наружной стороны делят маркером на сектора. Каждую исследуемую культуру засевают штрихом с помощью бактериологической петли на отдельный сектор в чашки с разными концентрациями антибиотика. Чашки помещают в термостат при температуре, оптимальной для роста и развития изучаемых бактерий, и инкубируют в течение 40 - 72 часов. Результаты учитывают по наличию или отсутствию роста бактерий в сравнении с ростом на среде в контрольной чашке. Бактерии считаются чувствительными к антибиотику в такой его концентрации, при которой их рост полностью подавляется.

 

ДЕМОНСТРАЦИИ

1. Демонстрация ферментативной активности бактерий с использованием СИБ для межродовой дифференциации бактерий.

2. Ферментативная активность представителей семейства кишечных бактерий на средах Гисса (Е.coli).

3. Обнаружение выделения сероводорода и индола.

4. Действие летучих и нелетучих фракций фитонцидов чеснока у бактерии.

5. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методами: а) диффузии в агаре с помощью бумажных дисков и градуированных полосок (Е-тест); б) серийных разведений.

6. Определение концентрации антибиотика в сыворотке крови.

7. Флаконы и ампулы с различными антибиотиками и дисками для определения антибиотикочувствительности.

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

1. Каждый студент учитывает рост культуры на скошенном агаре, приготавливает мазок, окрашивает по Граму.

2. Бригада студентов производит пересев культуры со скошенного агара на «пестрый ряд» (изучение биохимических свойств).

3. Бригада студентов определяет чувствительность выделенной культуры к антибиотикам методом бумажных дисков.

 

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Какую роль выполняют ферменты у бактерий?

2. Какова классификация ферментов у бактерий?

3. Каков принцип идентификации бактерий по биохимическим свойствам?

4. Как изучаются сахаролитические свойства бактерий и какие питательные среды для этого применяются?

5. Как и на каких питательных средах изучаются протеолитические свойства бактерий?

6. Что такое «пестрый ряд»?

7. Что собой представляет СИБ и в чем ее назначение?

8. Какие газообразные продукты образуются при расщеплении бактериями белков и как их определяют?

9. Назовите ферменты биологического окисления и как их выявляют?

10. Назовите формы симбиотических взаимоотношений между микроорганизмами.

11. Каковы формы конкурентных взаимоотношений между микроорганизмами?

12. Что такое микробный антагонизм и каковы практические аспекты его применения?

13. Что такое химиотерапия, каковы ее принципы?

14. Какие существуют химиотерапевтические препараты?

15. Что такое химиотерапевтический индекс?

16. Что такое антибиотики?

17. Какова классификация антибиотиков по способам получения, по химическому строению, происхождению, механизму и спектру антимикробного действия?

18. Каков механизм действия противоопухолевых антибиотиков?

19. Какие вы знаете осложнения антибиотикотерапии?

20. Как предупредить развитие дисбактериоза при антибиотикотерапии?

21. Как предупредить или снизить выраженность побочного действия антибиотиков на организм больного?

22. Каковы механизмы формирования антибиотикорезистентных культур?

23. Что способствует формированию антибиотикорезистентности у бактерий?

24. Какие мероприятия могут способствовать предупреждению формирования антибиотикорезистенности у бактерий?

25. Какие существуют методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам?

26. В чем заключается проблема получения и применения противовирусных химиопрепаратов?

27. Что такое аномальные нуклеозиды и каков механизм их действия при лечении вирусных инфекций?

28. Каков механизм действия азидотимидина и других веществ, ему подобных, применяемых для лечения СПИДа?

 

ЗАНЯТИЕ №8

Темы: