Классикалық ПЦР әдісі

Тізбекті полимеразды реакция Тізбекті полимеразды реакцияны 1983 жылы Кэри Маллисом ашқан. Оның мақсаты ДНҚ ферментті полимеразаның көмегімен ДНҚ-ны амплицирлеу және ДНҚ-ң алғашқы молекуласының барысымен көптеп екі еселенуі. Тізбекті полимеразды реакция (полимераза цепная реакция)– бұл молекулалық биологияның экспериментальді әдісі, биологиялық материалда (сынамада) нуклеин қышқылының (ДНҚ, РНҚ) белгілі фрагменттерінің аз концентрациясын көбірек игеру. Негізгі қолдану көрсеткіштері: Инфекциялық аурулардың диагностикасы- ГЕПАТИТТІҢ БАРЛЫҚ ТҮРЛЕРІНЕ ТЕКСЕРІЛЕСІЗ. Онкологиялық аурулардың диагностикасы (лейкемиялар және лимфомалар, сүт безі рагі т.б. қатерлі жаңатүзілістер); Генетикалық аурулар диагностикасы; Жеке идентификация (сот медицинасы және криминалистика, мүшелер мен тіндер трансплантациясы, генетикалық тест арқылы әкелікті анықтау); Тағам патогенділігінің диагностикасы. ТПР САТЫЛАРЫНЫҢ ЕРЕКШЕЛІКТЕРІ: ТПР 3 негізгі сатыдан тұрады,. Бұл цикл термоциклді аппаратта жүреді, ол оте аз уақыт ішінде қоспалық реакцияның температурасын жоғарылатады немесе төмендетеді. Денатурация – 94°C жуық: Денатурация кезінде ДНК-ң 2 тізбегі балқиды да бір тізбекті болып түзіледі. (барлық энзимді реакциялар тоқтайды). Аннеалинг (күйдіру) – 54°C жуық: Сутектік байланысы біртіндеп құралады және бір тізбекті ДНК мен жалғыз праймерлер арасы бұзылады..Әрбір цикл ДНК жібінің санын екі еселендіреді. Нәтижесінде ДНҚ кесіндісінде праймерлер арасындағы түзілістердің көлемі кенеттен жоғарылайды. 20 циклдан кейін синтезделген ТПР өнімінің санының көлемі 1 млн. дейін жетеді. 40 циклдан кейін — 1 x 1012 ТПР-дың қасиеті: Арнайылығы Жүргізілуі Сезімталдығы Сенімділігі ТПР ерекшеліктері: Nested PCR (ұяшықты – праймерлермен салынған ТПР RT-PCR – пцр, матрицаның орнына РНК қолданылуы, реакцияның кері транскрипциямен жүруі Real time PCR – ТПР шынайы уақыт тәртібінде зерттеудің жасалынуы Тізбекті полимеразды реакцияның өнімінің дұрыс шығуына шығуы және арнайылығын жақсартатын өнімдер: Tа ДНК-ға және праймерлерге – формамид, диметилсульфоксид (ДМСО), сперимидиндерге әсер етушілер ДНК (белок SSB, белок 34 фагтарға Т4) конформациясына әсер етушілер Полимераза қасиетіне әсер етушілер (бетаин, желатин, глицерин) Амплификация бағдарламасы қалай құралады: Реакциялық қоспаны біріншілік қыздыру – 90-95 0С – 1-5 мин ДНҚ денатурациясы- 90-95 0С – 5-10 сек. Праймерлерді күйдіру– 50-55 0С – 10-15 сек Элонгация (праймерлерді алып тастау) –68-72 0С Циклдер саны — 38-40 Соңғы элонгация (соңғы құралуы) –72 0С – 5-10 мин ТПР өнімдерін сақтау – 4-10

ДНҚ чип әдісі

ДНҚ биочиптері – ағылшын тілінде аталуы DNA – microarrays, шыныдан, полимерлерден, гельден (полиакриламид) немесе пластикадан дайындаған арнайы қалыпта, пластина-платформасында ұйымдастырылып орналасқан ДНҚ молекулалары. Кей жағдайда басқа материалдар да қолданады, мысалы электронды микросхемаларға салатын кремнийді. ДНҚ биоматериал ретінде шұнқырда гидрогельмен (гельді биочиптер) немесе чиптің тығыз қалыпында иммобилизацияланған (беткейлік биочиптер) болуы мүмкін. ДНҚ молекуласын иммобилизациялау үшін қалыптың бетін арнайы реактивтермен – органотриалкоксиланмен, глицидилоксисиланмен және т.б. өнделінеді. Осылай өнделу барысында беткейлік атомдар мен модификацияланған реагентер арасында силоксанды көпір пайда болады, нәтижесінде олигонуклеотидтердің иммобилизациясына қажетті немесе «аяқтың» бірнеше сатыдан кейін қалыптасуы олигонуклеотидтердің үлкен конформациялық бостандығын қамтамасыз ететін қалыптың бетінде көп санды функциональды топтар (негізінен, амин топтары) құрайды. Робот көмегімен ДНҚ бір жіпті фрагменттері – олигонуклеотидтер (қысқалары – 15-60 нуклеотидтер және ұзындары – 100-3000 нуклеотидтер) иммобилизацияланады (негізінен, ковалентті), (сур.19). Сондықтан биочиптерді олигонуклеотидті және ДНҚ-ды беткейлік түрлеріне бөледі. Платформада ұйымдастырылып орналасқан ДНҚ пошта маркасынан визитті карточкадай жерде орналастырады. Биочиптің микроскопиялық көлемінде тексерілетін материалдың комплементарлы нуклеин қышқылдар жіптерімен байланысу қабілеті бар оңдаған және жүздеген мың түрлі олигонуклеотидтер, ДНҚ фрагменттер орналастыруға болады. Осылай дайындаған ДНҚ-биочипті бояумен таңбаланған зерттелетін ДНҚ молекуласымен гибридизация жасайды және оқуға арналған флюоресцентті микроскоп немесе арнайы лазерлі қондырғымен шұнқырлардағы ақпаратты оқып шығарады. ДНҚ-биочиптері кеңінен таралған және шыны қалыпында орналасады.

ДНҚ-биочипті қолдану сызбанұсқасы: 1) талдау материалынан бөліп алынған гибридті (зерттелетін) ДНҚ алдымен ПТР көмегімен көп көлемде жинайды. Жетілдірген модельдерде гибридизация жасайтын ассимЕтриялық мультипраймерлі ПТР-амплификация бірден биочип шұнқырларында өтеді. Сонымен қатар, осы чипте ДНҚ фрагментациясы, фосфорилдену, лигирленуі жүреді. Зерттелетін ДНҚ амплификациядан кейін рестриктаза-ферментерімен белгілі фрагменттерге бөлінеді де флуоресцентті таңбасы бар фрагменттерді коньюгациялауына алғашқы өнделуден өтеді. Тексерілетін ДНҚ құрылымды бөліктері болып келетін көптеген санды таңбаланған олигонуклеотидтер жинағы пайда болады; 2) диагностикалық белгілі олигонуклеотидтері бар биочиптің гельдік микрошұнқырларына тексерілетін (гибридизацияланатын) ДНҚ микротамшысы тамызылады; 3) шыныда біржіпті олигонуклеотидтерді енгізіп тексерілетін нуклеин қышқылдарының гибридизациясы жүреді. ДНҚ комплементарлы жіптерінің гибридизация процесі жүруіне чипті түнге термостатқа инкубация жасайды. Егер тексерілетін сынамада олигонуклеотид шұңқырға бекітілгенге комплементарлы болған жағдайда олардың арасында байланыс орнығады, ортаны шайғанда олар қалып қояды, ал байланыспаған олигонуклеотидтер шайылып кетеді; 4) арнайы компьютерлі бағдарламалар қолданатын анализаторлар көмегімен гибридизация қорытындыларына визуализация және шыққан суреттемеге талдау жасалынады (сур.20,21). Осы мақсатта шайып алған биочипті кептіреді де анализатор көмегімен шұнқырлардағы флуоресцентті жарықтанудың активтілігін анықтайды.